木芙蓉（Hibiscus mutabilis）别名拒霜花，属锦葵科木槿属，原产于中国，在东亚及东南亚地区均有分布。其花大色艳且花期较长（杨苑钊等，2019）。木芙蓉具有较强的固碳、释氧、降温的能力，在城市园林中具有重要的应用价值（郑鹏等，2012）。成都市植物园长期以来致力于市花木芙蓉的研究及应用，并培育了许多抗病抗虫品种和不同花期的品种（王莹，2017）。但是，长期以来的人工选育和自然杂交导致木芙蓉品种间遗传关系错综复杂、亲缘关系不明、分类和进化关系模糊。对木芙蓉进行品种分类以及探讨其亲缘关系，对于木芙蓉品种间杂交以及新品种的选育具有重要意义（张璐等，2021）。台湾芙蓉（H. taiwanensis）别名狗头芙蓉或山芙蓉，亦属于木槿属，原产于台湾阿里山，是当地特有的原生种（Lim，2014）。据中国植物志记载，台湾芙蓉非常像木芙蓉，区别仅为前者全株具糙硬毛和粗糙的毛被，而后者全株为星状绒毛，因此，有学者提出两者可能不是明确的2个种（冯国楣，1984）。此外，木芙蓉与台湾芙蓉很容易杂交，坐果率为57.89%，这与木芙蓉品种之间杂交的坐果率62.50%相差无几，而木芙蓉与朱槿杂交坐果率为8.33%，与木槿杂交成功率更低，这在某种程度上反映了亲缘关系的远近。遗传信息不足通常使我们无法充分了解栽培植物和近缘种，明确栽培种和野生近缘种之间的遗传变异对将近缘种的有利性状引入栽培品种至关重要（Amar et al.，2019）。因此，我们需要开发更多的遗传信息，以便能够比较栽培种的遗传差异，并快速和准确地鉴定它们，从而更有效地利用这些物种（Peng et al.，2021）。

叶绿体基因组（cpDNA）大小为75~250 kb，大多数植物的cpDNA由大约 120 个基因组成，包括转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和蛋白质编码基因（protein-coding gene，PCGs）。cpDNA因结构简单、高度保守、拷贝数多而分子量少的特点，已被应用于分子标记开发和系统发育等研究中（杨俏俏等，2019）。越来越多的研究表明，叶绿体基因工程在植物遗传改良方面具有很大优势，叶绿体已经成为植物遗传转化的新工具（母连胜等，2017）。前人关于木芙蓉的研究大多集中在木芙蓉栽培育种（王莹，2017; 石小庆等，2021）和化学成分上（蔡露等，2021; 王艺等，2021），鲜有关于木芙蓉品种间以及与其近缘种间亲缘关系的研究。近年来，有学者在木芙蓉和台湾芙蓉的cpDNA分析和亲缘关系研究上取得了一定的进展，Abdullah等（2021）第一次对包括木芙蓉在内的3个物种的cpDNA进行了测序和比较分析，但其研究对象为整个锦葵科的3个不同属植物，范围偏大。本团队的Xu等（2019）对台湾芙蓉的cpDNA进行了报道; 张璐等（2021）采用扫描电镜观察了一些木芙蓉品种的花粉显微结构，并探讨了其分类学意义。花粉稳定性极强，在一定程度上能反映植物演化和亲缘关系，并对物种鉴定有一定的分类价值（彭焕文等，2018），但基因组层面的分子数据具有海量的遗传信息，通常认为与基因组层面的研究相结合有助于更精确和深入地进行亲缘关系和物种鉴定的研究。而迄今为止公布的木芙蓉品种的遗传信息很少且未有对木芙蓉品种间及其与近缘种台湾芙蓉间的cpDNA相关研究，极大地阻碍了木芙蓉品种的系统发育和优良性状改良研究。由于cpDNA并非都是母系遗传，只是在大多数被子植物中为母系遗传，因此在裸子植物中主要为父系遗传。此外，少部分被子植物的cpDNA存在父系遗传和双亲遗传的现象（Neale &Sederoff，1989），为了探索木芙蓉的cpDNA遗传方式，我们选取一个杂交组合中的3个木芙蓉品种，首次对木芙蓉品种及其近缘种台湾芙蓉cpDNA进行比较分析和系统发育分析。

本研究拟探讨以下科学问题:（1）木芙蓉3个品种及其近缘种台湾芙蓉的cpDNA有什么进化特征;（2）木芙蓉与其近缘种台湾芙蓉间有怎样的亲缘关系;（3）在cpDNA的组成和结构方面，能否开发出品种鉴定的分子标记或DNA条形码;（4）探究木芙蓉cpDNA的遗传方式。本研究结果将为木芙蓉的品种鉴定、进化研究和植物遗传改良、优良品种选育提供重要的第一手遗传资料。

1 材料与方法

1.1 木芙蓉品种材料来源

3个木芙蓉品种采自成都市植物园（104°8′11″ E、30°45′52″ N），分别为‘单瓣白’（H. mutabilis cv. Danbanbai）、‘金秋颂’（H. mutaibilis cv. Jinqiusong）、‘牡丹粉’（H. mutabilis cv. Mudanfen）。这3个品种为杂交组合，其中‘单瓣白’是母本，‘牡丹粉’是父本，‘金秋颂’为子一代，这样有利于对木芙蓉叶绿体的遗传方式进行探讨。从生态特性来看，‘单瓣白’和‘牡丹粉’为早花品种，花期为6—9月，‘金秋颂’为中花品种，花期为9—10月。从形态上来看，‘金秋颂’为重瓣花，雄蕊退化，有子房但不结实，另外2种结实。‘单瓣白’为单瓣花，花白色，‘牡丹粉’和‘金秋颂’分别为粉色和红色。‘牡丹粉’的花形似牡丹且平均花径比前两者大。近缘种台湾芙蓉的花期始于10月下旬，结实，花为单瓣，白中带粉。花的形态如图版Ⅰ所示。

1.2 基因组DNA的提取和测序

采集3个木芙蓉品种新鲜健康的叶片，用改良CTAB法从叶片组织中提取总基因组DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳和荧光染料（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）评估DNA产物的质量和浓度。采用Illumina TruSeq Nano DNA LT文库制备实验流程构建插入片段大小（insert size）为400 bp的DNA文库。应用Illumina NovaSeq平台对DNA文库进行二代测序（paired-end，2×150 bp）。DNA提取及测序均在南京派森诺基因科技有限公司完成。

1.3 cpDNA的组装和注释

每个物种得到了至少5G的原始数据（raw data），经过数据过滤后，使用NOVOPlasty（Dierckxsens et al.，2017）软件（k-mer = 39）进行组装拼接，选择台湾芙蓉的rbcL基因作为种子序列（seed sequence）。利用在线程序GeSeq（Tillich et al.，2017）注释cpDNA序列，并用Geneious v9.0.2（Kearse et al.，2012）进行手动校正。将带有注释信息的3条序列上传至NCBI数据库，‘单瓣白’‘金秋颂’‘牡丹粉’的序列号分别为MZ846191、MZ846192、MZ855502。借助在线程序Oranellar Genome DRAW（Greiner et al.，2019）绘制cpDNA的物理图谱。台湾芙蓉的序列号为MK937807，亦为本项目的研究成果（Xu et al.，2019）。本文中用到的其他cpDNA序列均下载于NCBI，其详细信息见表1。

1.4 cpDNA比较分析

使用MISA（MicroSatellite identification tool）（Beier et al.，2017），识别木芙蓉3个品种即台湾芙蓉、木槿和朱槿基因组中的微卫星序列（SSR）。参数设置:单核苷酸（mono-）、双核苷酸（di-）、三核苷酸（tri-）、四核苷酸（tetra-）、五核苷酸（penta-）、六核苷酸（hexa-）SSR的最小重复次数分别为10、5、4、3、3、3。利用REPuter（Kurtz et al.，2001）来分析木芙蓉3个品种和台湾芙蓉cpDNA中的重复类型（Hamming距离设置为3，重复序列的最小长度限制为30）。借助IRscope（Amiryousefi et al.，2018）绘制木芙蓉3个品种即台湾芙蓉、木槿和朱槿cpDNAIR边界的扩张和收缩。使用mVISTA（Mayor et al.，2000）中的Shuffle-LANGAN模式对木芙蓉3个品种即台湾芙蓉、木槿和朱槿的cpDNA序列进行全局比对，以评估序列之间的相似性。使用DNAsp 6（Librado &Rozas，2009）软件计算序列之间的核苷酸多态性。使用Geneious v9.02（Kearse et al.，2012）分别提取每个物种的蛋白编码区域（CDS），存在多拷贝的基因仅保留1条。使用Codon W（Sharp &Li，1987）计算这些CDS的同义密码子的相对使用度（related synonymous codon usage，RSCU）。

1.5 系统发育分析

使用phylosuite（Zhang et al.，2020）提取17个物种cpDNA的CDS，删去重复基因和非共有的基因后，使用MAFFT对序列进行比对，之后使用MACSE优化序列，用Gblock修剪比对好的序列，最终使用concatenate功能将序列串联。使用Modeltest检测最佳核苷酸替代模型为JC+I+G。使用MrBayes进行贝叶斯（Bayesian inference，BI）分析。基于Markov chain Monte Carlo（MCMC）算法，运行1×10⁷代，每1 000代取1棵树，前20%的树当作老化样本丢弃，剩余的树用于构建一致树。使用IQtree进行最大似然法（maximum likelihood，ML）分析，重复次数为1 000。将建树结果使用在线程序iTOL（Ivica &Peer，2021）进行美化。

2 结果与分析

2.1 cpDNA基本特征

如图1所示，‘单瓣白’和‘金秋颂’的长度差异较小，分别为160 880、160 879 bp，仅相差1个碱基，而‘牡丹粉’的长度与前2种则有稍大的差异，为160 920 bp。三者的cpDNA呈现出典型的四分体环状结构，均由1对反向重复区（inverted repeats，IR）（IRa 和IRb，长度均为26 300 bp）以及1个大单拷贝区（large single copy，LSC，长度分别为89 355、89 353、89 400 bp）和1个小单拷贝区（small single copy，SSC，长度分别为18 925、18 926、18 920 bp）组成。从表2可以看出，台湾芙蓉的LSC区长度明显长于3个木芙蓉品种，而在品种内部，‘单瓣白’与‘金秋颂’的LSC区与SSC区长度相差1~2 bp，但与‘牡丹粉’相差较大。

木芙蓉的cpDNA共有130个基因，包含85个蛋白编码基因（PCGs）、37个tRNA和8个rRNA。大多数基因以单拷贝形式出现于LSC区或SSC区中，其中SSC区中有13个基因，包括12个PCGs（ndhF、rpl32、ccsA、ndhD、psaC、ndhE、ndhG、ndhI、ndhA、ndhH、rps15、ycf1）和1个tRNA（trnL-UAG）; LSC区中有85个基因，包括63个PCGs和22个tRNA。仅有17个基因在 IR 区重复，包括 6个PCGs（rpl2、rpl23、ycf2、ndhB、rps7、rps12）、7个tRNA（trnI-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU）和4个rRNA（rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5）。ycf1基因跨越SSC区和IR区，rps12基因第一个外显子位于LSC区，其他2个外显子位于IRs区。17个基因有1个内含子，ycf3和clpP基因有2个内含子。所有基因按照基本功能划分为表达相关基因、光合作用相关基因和其他基因三类，每类基因的名称和数量展示在表3中。

2.2 IR边界分析

通过比较木芙蓉3个品种即台湾芙蓉、朱槿和木槿cpDNA的IR/LSC和IR/SSC边界区域的基因分布状况，识别IR的扩张或收缩。如图2所示，IR/LSC和IR/SSC边界附近分布的基因包括rps19、rpl2、ycf1、ndhF、trnH，木芙蓉3个品种与台湾芙蓉之间IR边界一致。6条序列的SSC/IRa边界均为ycf1基因，在木芙蓉和台湾芙蓉SSC区长度均为4 026 bp，而在朱槿和木槿的SSC区长度分别为5 599、5 083 bp。ndhF基因在6条序列中均位于SSC区内，其中木芙蓉和台湾芙蓉的ndhF基因距SSC/IRb边界均为32 bp，其余2种距边界150 bp。同样，rpl2基因在6条序列中均位于IRb区内，其中木芙蓉和台湾芙蓉的rpl2基因距LSC/IRb边界均为103 bp，朱槿距边界67 bp，木槿距边界113 bp。

2.3 叶绿体微卫星分析和重复序列分析

微卫星序列（microsatellite DNA），也叫简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），是1~6 bp的重复序列，广泛分布于cpDNA。SSR具有高度多态性和特异性，是研究基因流、种群遗传学和基因作图的有价值标记（Chen et al.，2015）。在本研究中，我们分析了6种SSR（单、二、三、四、五、六核苷酸SSR）在6条cpDNA中的分布。如图3所示，数量最多的均为单核苷酸重复，占比从66.67%到74.55%不等，均比其他所有重复类型加起来还多。木芙蓉3个品种的SSR总数为95，台湾芙蓉与其非常近似，为96。作为对照，朱槿和木槿分别为63和110，差异较大。木芙蓉3个品种和台湾芙蓉的基因组中存在6种完全微卫星序列，而朱槿和木槿中不存在六核苷酸重复。木芙蓉3个品种与台湾芙蓉的共同区别仅仅在于前者均只有1个五核苷酸重复，而后者存在2个五核苷酸重复。木芙蓉3个品种中，‘牡丹粉’明显区别于另外2种，‘牡丹粉’的单核苷酸重复比另外2种多1个，而六核苷酸重复比另外2种少1个。

注: *1个内含子; **2个内含子; a. 重复基因。

Note: *One intron; **Two introns; a. Duplicated gene.

重复序列有4种类型，即正向（forward）、反向（reverse）、互补（complement）、回文（palindromic）。如图4所示，木芙蓉3个品种中均检测到4种类型的重复，而台湾芙蓉无互补重复; 木芙蓉3个品种均为22个正向重复和3个反向重复，而台湾芙蓉的正向重复和反向重复分别为26和1。木芙蓉3个品种间的4种重复的比例十分类似，但同时互相之间则存在着差异。虽然三者的正向重复均为22个，但其构成略有差别，‘牡丹粉’重复单元长度为30~39和40~49的正向重复数量分别为16和6，而其他2种都分别是17和5; ‘单瓣白’和‘金秋颂’的回文重复均为12个，而‘牡丹粉’为11个; ‘单瓣白’和‘牡丹粉’的互补重复均为2个，而‘金秋颂’为1个。

2.4 核苷酸多态性分析

利用mVISTA在线程序，比对了木芙蓉3个品种即台湾芙蓉、朱槿、木槿的cpDNA。其中，‘单瓣白’作为参考序列，朱槿和木槿则作为对照。从图5可以明显观察到朱槿、木槿均与参考序列差异较大，而‘牡丹粉’‘金秋颂’台湾芙蓉则与参考序列差异较小。5个cpDNA中高度分化的区域主要位于基因间隔区，但一些蛋白编码区如ycf1基因变异度较大，而最保守的4个rRNA基因，在木芙蓉3个品种和台湾芙蓉中完全一致。

为了更加精确地反映木芙蓉3个品种之间以及与台湾芙蓉间的核苷酸多态性，我们分别计算了‘金秋颂’‘牡丹粉’台湾芙蓉的CDS和基因间隔区相对于参考序列单瓣白的核苷酸多样性值（nucleotide diversity values，P_i）。如图6所示，CDS序列较为保守，其P_i普遍较小。就CDS序列来看，‘金秋颂’仅在ycf1基因处出现多态性，‘牡丹粉’仅在ndhB基因处出现，台湾芙蓉在accD、atpA、clpP、ndhB、ndhD、matK、ycf1均出现，但P_i最大不超过0.001 7。而在基因间隔区中，台湾芙蓉有14个基因间隔区有差异，其中trnR-UCU~atpA、psbZ~trnG-GCC、infA~rps8、ndhE~ndhG这4个基因间隔区为台湾芙蓉的变异热点区域，其P_i均不低于0.004 18。这4个高度可变的区域有3个在LSC区，有1个在SSC区，IR区中P_i较小，均小于0.020 9。‘牡丹粉’有3个基因间隔区有多态性，其中psbZ~trnG-GCC、ycf4~cemA为牡丹粉的热点变异区域且这2个热点都在LSC区。显然，IR区的变异低于LSC区和SSC区。‘金秋颂’无基因间隔区差异。这些变异度较高的区域，可用于设计特定的DNA条形码。

2.5 选择压力分析和密码子偏好性分析

相对同义密码子使用度（RSCU）用于评估编码序列中同义密码子的使用情况，其中RSCU越大表示偏好性越强。我们选取了木芙蓉3个品种、台湾芙蓉以及其他13个相关物种，测定了每个物种cpDNA的密码子的数量以及RSCU。计算结果表明，基因组中亮氨酸含量最高，异亮氨酸和甘氨酸其次，编码半胱氨酸的密码子数量最少，次少为色氨酸和丝氨酸。如图7所示，除色氨酸和甲硫氨酸外，所有氨基酸都使用2个或多个同义密码子，精氨酸和亮氨酸均由6个同义密码子表达。RSCU值较大的密码子大部分为A或U结尾，即基因上的碱基A/T，这与前人的研究结论一致，即植物中A/T结尾的密码子使用偏好（Xie et al.，2018）。如图7所示，锦葵科植物的密码子偏好表现出较高的保守性，但不同属之间存在着一定的差异。木芙蓉3个品种和台湾芙蓉紧紧地聚在一起，其余物种大致是按照属和族进行聚类。

2.6 系统发育关系

我们选取16个锦葵科植物的cpDNA来探讨木芙蓉与其近缘种间的亲缘关系，并以木棉科植物美丽异木棉（Ceiba speciosa）作为外类群。使用17个cpDNA中共有的76个CDSs进行最大似然分析（ML）和贝叶斯分析（BI）。结果显示，ML和BI分析的拓扑结构完全相同，并且绝大部分的进化支都具有很高的后验概率（posterior probabilities）和自展值（Bootstrap values）。如图8所示，木芙蓉3个品种和台湾芙蓉同属于木槿属，并聚在同一枝亲缘关系最近，自展值和后验概率均为最大值。

3 讨论与结论

3.1 木芙蓉及近缘种的cpDNA比较

cpDNA比较分析表明，木芙蓉的种下3品种及其近缘种台湾芙蓉在cpDNA上高度保守，反向重复区（IR）均为26 300 bp，木芙蓉与该属的木槿和朱槿比较，后两者在IR区发生了收缩分别为25 745、25 598 bp。3个木芙蓉品种cpDNA上的大/小单拷贝区在长度上存在差异且‘单瓣白’和‘金秋颂’差异更小，在大/小单拷贝区（LSC/SSC）长度上，‘单瓣白’‘金秋颂’‘牡丹粉’分别为89 355 bp/18 925 bp、89 353 bp/18 926 bp、89 400/18 920 bp。GC含量是判断物种间亲缘关系的重要指标（Li et al.，2018），木芙蓉3个品种与台湾芙蓉的总GC含量、IR区和SC区的GC含量均完全一致，木槿和朱槿的GC含量则有明显差异。此外，木芙蓉3个品种与台湾芙蓉的IR区边界分布的ycf1、trnH、ndhF、rpl2、rps19基因均未发生扩张或收缩，而同属的木槿和朱槿相对木芙蓉和台湾芙蓉发生了明显的波动。不同物种之间的IR边界是不同的，其中IR边界的波动是造成这种差异的主要原因（Ravi et al.，2008）。因此，GC含量和IR区边界的情况在较大程度上说明了木芙蓉与台湾芙蓉的亲缘关系非常之近，而木槿和朱槿的亲缘关系则相对较远。

同义密码子是由突变产生的，进化压力导致这些同义密码子的使用频率发生变化（Hanson &Coller，2017）。密码子偏好性是物种对其碱基组成、tRNA 丰度和环境选择压力长期适应的结果（Novoa &de Pouplana，2012; Behura &Severson，2012）。此外，密码子偏好性会影响翻译的起始、延伸和准确性、mRNA 的剪切和蛋白质的折叠（任桂萍等，2019）。因此，密码子偏好性在一定程度上也能反映出亲缘关系。文中密码子偏好性聚类结果将台湾芙蓉与木芙蓉3个品种聚在一起，‘金秋颂’与‘单瓣白’的密码子偏好性无差异，‘牡丹粉’和台湾芙蓉相比前者编码亮氨酸密码子UUA的偏好性略高，其中台湾芙蓉还在缬氨酸和丝氨酸的密码子偏好上表现出差异，从密码子偏好性上我们能判断出木芙蓉和台湾芙蓉的亲缘关系很近，且‘单瓣白’与‘金秋颂’最为近似。一些陆生植物，如花生、樱桃和萝卜等，cpDNA的大小和结构，以及基因的含量和顺序，在栽培种和野生近缘物种中高度保守（Cho et al.，2018; Wang et al.，2019）。木芙蓉3个品种与其近缘种台湾芙蓉进化特征高度保守，再次证实了这一结论。木芙蓉与台湾芙蓉形态上的差异非常小，区别仅为植株的毛被类型，而木芙蓉与木槿和朱槿在形态上则有较大的区别。木芙蓉与台湾芙蓉杂交坐果率较高，而与朱槿和木槿杂交坐果率很低甚至无法杂交成功。张璐等（2021）在木芙蓉品种花粉的研究中根据形态将‘单瓣白’和‘金秋颂’聚在一起，而‘牡丹粉’聚在另一枝。因此，本研究结果验证了形态和育种上的事实，能够较好地研究进化特征和判断亲缘关系的远近。此外。木芙蓉3个品种是一个杂交组合，其中‘单瓣白’是‘金秋颂’的母本，两者最为近似，因此可以判断出木芙蓉的cpDNA为母系遗传，这为木芙蓉育种和遗传的研究打下了一定的理论基础。

3.2 木芙蓉及近缘种的cpDNA系统发育关系

从系统发育树看，木槿属聚成了一个支持率非常高的单系类群，表明木槿属为一较为自然的分类群，系统发育树支持该属的建立。木芙蓉种下3个品种聚成一个支持率99%的单系支，然后再与台湾芙蓉聚成一个高支持率（100%）分支，表明木芙蓉和台湾芙蓉的亲缘关系最近; 从系统树看，海滨木槿、黄槿、大麻槿构成单系分支后，再与木芙蓉、台湾芙蓉构成的分支相聚; 相较于木槿和朱槿，木芙蓉、台湾芙蓉与海滨木槿、黄槿、大麻槿在亲缘关系上更近。除了cpDNA的结构特征可以反映出木芙蓉3个品种与台湾芙蓉的亲缘关系外，系统发育分析能更直观地反映出这一关系。在系统发育树中，木芙蓉3个品种聚在一起，与其亲缘关系最近的为台湾芙蓉，与木槿和朱槿的亲缘关系则相对较远。此外，建树结果显示木槿属形成了一个单系。在冯国楣（1984）的分类处理中，他按照宏观形态将棉属和桐棉属归入木槿族。但彭焕文等（2018）在孢粉学研究表明，棉属、桐棉属与木槿属的花粉有较大差异，与锦葵族的一些物种花粉差异很小。本研究中，棉属、桐棉属与锦葵族聚在一起，而与木槿属分开，支持之前孢粉学的研究结果。系统发育分析结果表明cpDNA数据对于研究系统发育问题是非常有效的。

3.3 木芙蓉及近缘种的cpDNA分子条形码

从重复序列和核苷酸多样性分析中可以开发出候选分子标记和DNA条形码，可以作为品种鉴定的分子条码。我们筛选出了木槿属下种级、木芙蓉种下3个品种级cpDNA的候选特异性分子标记和DNA条形码，利用所筛选的这些特异性的标记，可将种级水平物种区分开; 再将其用于观赏花卉价值极高的木芙蓉种下品种间，亦可将‘单瓣白’‘金秋颂’‘牡丹粉’这3个区分开。

微卫星和重复序列广泛存在于 cpDNA中，可用于种群遗传学研究和分子标记的开发（Bull et al.，1999; Chen et al.，2015）。木芙蓉的微卫星结构与木槿和朱槿有明显的区别，但与台湾芙蓉区别不太明显，且在木芙蓉品种内部，通过微卫星结构无法区分‘单瓣白’和‘金秋颂’。相比较而言，重复序列结构分析则能明显地区别台湾芙蓉和‘木芙蓉’，并能对木芙蓉3个品种进行明显区分。所以，重复序列分析能够更加有效地鉴定木芙蓉品种。叶绿体DNA条形码是指具有足够变异的短DNA序列，通常被认为有助于快速、准确地鉴定物种（程芳婷等，2015）。通过核苷酸多态性分析我们筛选出了台湾芙蓉与木芙蓉之间的叶绿体DNA条形码，包括trnR-UCU~atpA、psbZ~trnG-GCC、infA~rps8和ndhE~ndhG。也筛选出了木芙蓉3个品种之间的DNA条形码，分别为psbZ~trnG-GCC、ycf4~cemA、ndhB和ycf1。可以看出大部分热点区域为基因间隔区，这是因为基因间隔区处于较弱的选择压力下，并且具有比基因更高的进化速度，它们更适合于低分类阶元的系统发育和进化研究（陈士林等，2009）。台湾芙蓉与‘单瓣白’差异最大，有7个基因和14个基因间隔区出现不同程度的差异。‘牡丹粉’与‘单瓣白’之间的差异仅有1个ndhB基因和3个基因间隔区。ndhB基因属于NADH脱氢酶基因，其缺失突变会导致光合作用中碳同化能力严重下降，植物可以通过对该类基因进行RNA编辑来保证光调节作用（刘佳等，2019）。有研究证明，大豆的ndhB基因在水稻中超表达，提高了水稻的光合效率，进而影响了水稻的农艺性状（王晓曼，2016）。因此，我们推断‘牡丹粉’花径很大，花量更多，植株也更高大，或许与ndhB基因的改变有关。‘金秋颂’与‘单瓣白’差异最小，仅有1个蛋白编码基因ycf1基因发生替换。ycf1基因是具有未知功能的开放阅读框，但是烟草基因敲除实验证明ycf1基因编码对细胞存活至关重要的产物（Drescher et al.，2000）。与其他叶绿体基因相比，ycf1基因进化速度快，是植物中非常有用的分子标记，能够揭示低分类水平上的系统发育关系（Amar，2020）。因此，木芙蓉品种之间以及与近缘种之间可以通过一些基因间隔区和个别特殊基因（如ycf1、ndhB）进行快速且准确地鉴定。

参考文献