TIFY家族是一类包含TIFY结构域的植物特有转录因子（张沪等，2020），在应激反应中起重要作用（胡利宗等，2020; He et al.，2020），根据保守结构域的不同，TIFY基因家族分为TIFY、JAZ、ZML和 PPD共 4个亚蛋白家族（Vanholme et al.，2007; Bai et al.，2011）。TIFY亚家族仅含有TIFY 结构域（Staswick，2008），其他3类亚家族还包含其他结构域，如:ZM亚蛋白家族，包括ZIM（在花序中表达的锌指Meristem）和ZML蛋白，也都包含C2C2-GATA锌指DNA结合域和CCT域（CONSTANS，类似CO的TOC1）; JAZ亚蛋白家族包含一个保守序列，它们的C端附近大约有27个氨基酸，称为作为Jas基序，其顺序与N端相似CCT域的一部分（Kang et al.，2011）并带有特征基序SLX2 FX2 KRX2 RX5 PY（Hakata et al.，2012）; PPD亚蛋白家族具有独特的N末端PPD结构域（Kang et al.，2011）。

TIFY家族成员与植物的正常生长以及胁迫响应起着重要作用（赵晓晓等，2020）。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现，AtTIFY1（ZIM）在促进叶柄和下胚轴伸长中起重要作用（罗冬兰等，2017），而AtTIFY4a（PPD1）和AtTIFY4b（PPD2）参与了叶片生长（Alexandra et al.，2018）。拟南芥TOC1和CO 蛋白属于ZML 类群，主要参与光周期信号转导或者介导蛋白相互作用（Bai et al.，2011）。其他植物如柑橘（Citrus reticulata）低温胁迫（张沪等，2020）、水稻（Oryza sativa）盐胁迫（Ye et al.，2009）和小麦（Triticum aestivum）干旱胁迫（Ebel et al.，2018）等TIFY基因已有详细研究，表明TIFY 基因都积极参与植物的生长发育以及非生物胁迫。

茶树（Camellia sinensis）是很重要的经济作物，对我国的农业和国民经济发展具有重要作用（芦梅，2016）。近年来，茶树栽培面积的扩大，如贵州省茶树种植面积达50万hm²，由于生物和非生物胁迫引起的茶树灾害十分严重，如:茶芽萌发慢、长势劣、营养积累困难、病虫害多等问题，导致茶叶减产和茶叶品质下降（Cheruiyot et al.，2009; Liu et al.，2016）。目前，在茶树中有关TIFY家族相关报道极少，而茶树基因组测序数据的发布有利于从全基因组水平对茶树TIFY家族成员进行鉴定与分析（Wei et al.，2018; Wang et al.，2020）。本研究利用茶树基因组数据，鉴定了2个TIFY、7个ZML、2个PPD和8个JAZ基因，明确在茶树中的结构特点与进化特征，通过实时荧光定量（RT-qPCR）分析其在茉莉酸甲酯、干旱、冷和盐处理下的表达模式，以期探究该基因家族成员在茶树中的作用机制，为进一步研究TIFY基因家族在茶树胁迫防御机制研究奠定基础，为未来改善植物抗逆性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料处理

实验材料来自贵州大学教学实践茶园（106°39′18″ E、26°27′13″ N、海拔1 130 m），选取生长状态良好、长势基本一致的两年生福鼎大白茶树移栽花盆中（丹麦泥炭土），人工气候室条件设置为温度（22±2）℃，湿度65%的环境下进行干旱（20% PEG-6000溶液）、盐（20% 氯化钠溶液）和茉莉酸甲酯（1 mmol·L^-1）胁迫。将新鲜制备的 1 mmol·L^-1茉莉酸甲溶液喷洒在不同处理植株的叶片（1芽3叶）上进行激素处理，收集处理（0、12、24、 48 h）后的1芽3叶; 20%氯化钠溶液和20% PEG-6000溶液分别浇灌植物（500 mL溶液），收集两种处理（0、24、48、72 h）后的1芽3叶; 用光照培养箱进行4℃处理（0、12、24、48 h）的1芽3叶。每个处理 3个株系，锡箔纸包裹标记，液氮速冻后保存于-80℃保存备用。

1.2 茶树TIFY基因的鉴定与注释

从TPIA数据库（http://tpia.teaplant.org/）下载茶树基因组以及蛋白组数据。同时，根据已经鉴定的拟南芥TIFY序列提交给Pfam数据库（http://pfam.sanger.ac.uk）获取基因家族的基本结构，发现TIFY结构域由Pfam登录号PF06200表示。使用HMMER以E值1×e^-6搜索茶树基因组数据库（http://tpia.teaplant.org/）中的含有TIFY结构域的蛋白作为TIFY家族的候选蛋白，使用HMMER算法再次确认候选结构域是否完整，将TIFY基因家族候选蛋白提交至Pfam数据库查询具体保守结构域，删除不包含TIFY结构域的蛋白（蓝雨纯等，2020）。

1.3 序列比对和系统发育分析

TIFY家族系统进化分析:将拟南芥（Arabidopsis thaliana）TIFY（Vanholme et al.，2007）、毛果杨（Populus trichocarpa）（Wang et al.，2020）、葡萄（Vitis vinifera）（Zhang et al.，2012）及筛选到的茶树TIFY蛋白序列提交到Muscle软件，通过序列多重比对，使用IQtree软件计算氨基酸替换模型，使用IQtree软件通过ML（maximum likelihood）法生成进化树，设定自举值为1 000; 茶树TIFY种内进化分析:将茶树TIFY蛋白序列提交到Muscle软件，通过序列多重比对，使用IQtree软件计算氨基酸替换模型，使用IQtree软件采用ML法构建种内进化树，设定自举值1 000。

1.4 茶树TIFY染色体定位和基因结构分析

根据1.2的数据获取方法提取基因组注释数据中的TIFY基因在茶树染色体上的位置信息提交至TBtools软件，得到染色体定位图。茶树TIFY基因结构分析:将茶树TIFY家族成员内含子位置、数目信息和基因位置等信息提交至TBtools软件，获得基因结构图。茶树TIFY保守基序分析:将茶树TIFY蛋白序列提交至MEME 5.2（http://meme-suite .org/tools/meme），基序的数目设置为10，motif长度设置为6~50 aa，使用TBtools可视化相关数据。使用TBtools可视化TIFY基因家族保守结构域信息。

1.5 茶树TIFY启动子区顺式作用元件分析

根据1.2茶树基因组数据提取TIFY基因上游2 000 bp片段作为TIFY基因的启动子序列，提交至Plant Cis-Acting Regulatory Elements（http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/plancare/html/）分析启动序列的顺式作用元件，使用TBtools可视化相关数据。

1.6 茶树TIFY基因组织表达模式分析

根据1.2的数据获取方法获得茶树不同组织TIFY基因的表达量（TPM）以及非生物胁迫下TIFY基因在茶树中的表达量（TPM），使用TBtools软件制作基因表达图谱。

1.7 RT-qPCR分析

下载茶树TIFY基因家族序列，并使用IDT（Integrated DNA Technologies）网站（https://sg.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/）在线设计引物，选用CsGAPDH作为内参基因（表1）。按照试剂盒说明书提取茶树叶片RibonucleicAcid（RNA）（北京华越洋生物科技有限公司），然后按照试剂盒说明书（北京君诺德生物技术有限公司）逆转录成cDNA，用于实时定量RT-qPCR。利用RT-qPCR 仪（T100 Thermal Cycler，Bio-Rad公司）进行 RT-qPCR 反应，反应程序参考（Yao et al.，2020）。每个样品均设置 3 次技术重复。用2^-ΔΔCT算法计算基因相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 茶树CsTIFY基因的全基因组鉴定

共鉴定到19个TIFY序列，命名为 CsTIFY1-CsTIFY19，命名顺序参照Vv-TIFY（Zhang et al.，2012），分属4个亚家族，如表2 所示。

2.2 4种植物TIFY基因的系统发育分析

81个蛋白序列进行多重比对，利用IQ-TREE构建进化树，TIFY基因家族的4个亚家族成员构成及分布如图1所示，PPD 亚蛋白家族包含茶树CsTIFY4 与拟南芥AtTIFY4a、AtTIFY4b，但CsTIFY4与拟南芥AtTIFY4a亲缘关系较远; TIFY 亚蛋白家族包含CsTIFY15和 CsTIFY19; ZML亚家族由4个物种构成，共计20个成员; 剩余其他蛋白序列分属JAZ亚蛋白家族，可分为以下5个类群（JAZⅠ、JAZⅡ、JAZⅢ、JAZ IV、JAZ V），其中JAZⅠ 含有最多的TIFY序列，占比为 16/37，JAZ IV仅包含AtTIFY与CsTIFY序列，共计3个; JAZ V不包含CsTIFY（图1）。

2.3 茶树TIFY基因的功能结构域及结构序列分析

使用氨基酸进行了系统发育分析这里鉴定出19个茶树TIFY基因序列（图2）。使用来自4种植物的TIFY序列构建系统发育树（图1），同一个家族的TIFY蛋白倾向于聚类，2个例外是蛋白CsTIFY4和CsTIFY8单独聚为一枝（图2:A）。利用MEME软件对茶树TIFY保守基序组成和保守基序数目进行分析，共鉴别到10个保守基序，依次命名为motif 1~motif 10，只有CsTIFY8包含motif 2（图2:B），说明TIFY基因家族在进化过程中基序比较保守。相反是外显子/内含子结构也可用于提供其他证据来支持系统发育分组（Shiu &Bleecker，2003），因为这种类型的差异通常在基因家族的进化中起关键作用。因此，了解茶树TIFY基因的外显子/内含子结构（图2:C），以进一步了解它们可能的基因结构进化。我们的结果表明它们的系统发育与外显子/内含子之间有很强的相关性结构，并且聚在一起的基因通常拥有一个类似的基因结构。实际上，3组基因（TIFY2/TIFY3、TIFY12和TIFY14）包含完全相同数量的外显子，几乎完全相同的外显子长度（图2:C），表明这些TIFY基因可能是重复事件的产物。为进一步证实茶树TIFY基因之间的进化关系，可视化了其保守域的分布（图2:D）。尽管茶树TIFY蛋白质序列的氨基酸数量从115到399不等（表1），但聚集在一起的蛋白质往往包含相同数量的氨基酸。氨基酸和保守结构域的类似分布，这与外显子/内含子结构分析一致。

2.4 茶树CsTIFY基因染色体定位

19个茶树CsTIFYs基因分别分布在茶树的8条染色体上，分别是染色体2、3、6、8、9、12、13和15。分析出CsTIFY 基因同源基因簇4组，分别为位于3号染色体上的CsTIFY12 和 CsTIFY19，位于9号染色体上的CsTIFY13和CsTIFY17，位于12号染色体上的CsTIFY2和CsTIFY3，位于15号染色体上的CsTIFY9和CsTIFY10，其中还有一对同源基因CsTIFY14和CsTIFY15未定位到染色体上（图3）。

2.5 茶树CsTIFY基因启动子顺式作用元件

从图4可以看出MYB响应元件分布在每个TIFY基因中，circadian为光周期响应元件在TIFY基因中分布最少的，TIFY1和TIFY7包含的作用元件最多。

2.6 茶树CsTIFY基因胁迫下的表达分析

干旱、冷和盐等非生物胁迫对植物生长和生产力造成不利影响，MeJA处理后的表达数据（Donofrio et al.，2009; Zhao et al.，2020; He et al.，2020）说明其对于植物的生物逆境响应至关重要（Bari &Jones，2009），在本研究中，我们通过挖掘可公开获得的茶树微阵列数据集，研究了茶树TIFY基因家族对不同非生物胁迫条件以及激素处理的响应。我们确定了对应于19个茶树TIFY转录本，这些基因表达图谱如图5所示，茶树TIFY1基因对非生物胁迫和激素处理不同时间段表达量都很高，只有干旱胁迫和盐胁迫下TIFY1随时间的增减表达量降低，而激素处理后TIFY1、 TIFY2、 TIFY3、 TIFY6、 TIFY11、 TIFY12、 TIFY14和 TIFY16的表达高，而TIFY5和 TIFY7对非生物胁迫和激素处理在不同的时间段有负调控作用或不表达; TIFY6在激素、盐和干旱胁迫下表达量最高，而在冷胁迫下表达微弱。结果表明，不同的TIFY基因在非生物胁迫和激素处理下不同时间段表达量不同。

2.7 茶树CsTIFY基因在不同胁迫和外源茉莉酸甲酯处理下的表达分析

我们根据转录组数据分析了不同胁迫下的基因表达情况（图5），为了确信转录组结果，选择了干旱（20% PEG-6000）、冷胁迫（4℃）、盐胁迫（20% NaCl）和茉莉酸甲酯（MeJA）（1 mmol·L^-1），不处理为对照，并根据茶树基因组数据不同胁迫基因的表达量选择了7个TIFY基因，进行了实时荧光定量（RT-qPCR）分析。MeJA处理下，大多数TIFY有明显的响应，但不尽相同，如MeJA显著诱导了TIFY1、TIFY6和TIFY11的表达，表达量随时间的增加而增加，在12 h时表达量最高，随后降低，而TIFY15在不同时间段表达变化不大; 冷胁迫下，TIFY都存在响应，但不尽相同，如冷胁迫显著诱导了TIFY8和TIFY11的表达，表达量随时间的增加而增加，而TIFY2在不同时间段表达变化不大，TIFY6随时间的增加而增加，随后降低; 干旱处理下，TIFY基因均表达，但表达水平有一定差异，干旱胁迫显著诱导了TIFY6和TIFY11的表达，表达量随时间的增加而增加且在12 h时表达量最高，随后降低，而TIFY8表达基本没有影响; 盐胁迫下，TIFY1、TIFY2、TIFY11、 TIFY15和TIFY18随胁迫时间增加，随后降低，而TIFY6不随时间的变化而变化，可知转录组数的基因表达量和RT-qPCR基因表达量趋势基本一致（图6）。

2.8 茶树 CsTIFY 基因表达模式分析

将不同基因表达量数据进行热图分析，CsTIFY1、CsTIFY2、 CsTIFY3在各个组织表达量都较高，而CsTIFY5和CsTIFY7在各个组织几乎不表达且CsTIFY11在根、顶芽、嫩叶和花表达较高基本一致，其中CsTIFY6在顶芽表达量最高，表明茶树 CsTIFY 基因家族成员在不同组织器官表达均存在差异性，暗示其可能基因功能存在分化（图7）。

3 讨论与结论

TIFY基因是植物特有的转录因子，有可以调控植物分生组织分裂等重要作用，并显著影响植物的生长发育（赵晓晓等，2019; 温东等，2020; Liu et al.，2020; 沙伟等，2021）。尤其是JAZ 蛋白，不仅是茉莉酸（jasmonic acid，JA）信号通路的重要负调控转录因子，还是激素网络的调控枢纽，通过诱导茉莉酸刺激来启动茉莉酸应答基因的转录（吴莹等，2008）。水稻OsJAZ9与OsSLR 的互作介导了茉莉酸与赤霉素（gibberellin，GA）的拮抗作用来协调植株应急响应（Um et al.，2018）; JAZ1/JAZ4与CBF诱导因子相互作用抑制转录ICE1的功能，从而减弱了CREPEAT BINDING FACTORS（CBFs）的表达; JAZ1或JAZ4的过表达抑制拟南芥对冻胁迫的响应（Hu et al.，2013）; 在甘蓝型油菜（Brassica napus）BnaJAZ7-A3/BnaJAZ7-C3的过表达提高冷害胁迫（He et al.，2020）等中被研究，然而茶树TIFY基因特性和系统进化等却未见报道。

茶树中19个TIFY基因被鉴定，结果表明TIFY基因家族包含4个亚蛋白家族且各家族成员中TIFY-motif的氨基酸序列包含多种类型，TIFY 蛋白在拟南芥、水稻、毛果杨和茶树4个物种间分为7个类群。除CsTIFY8、CsTIFY14、 CsTIFY15和CsTIFY16 外，其他15个CsTIFY都分别分布在2、3、6、8、9、12、13和15染色体上，其中CsTIFY各成员在染色体形成了4对同源基因簇，说明该成员间存在一定的进化关系。

茶树TIFY基因家族进化关系较近的成员间具有基本相同的内含子/外显子组成，同水稻（Ye et al.，2009）和二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）（Zhang et al.，2015）研究的TIFY基因家族规律基本一致，不同分组的成员间的组成存在差异（Xu et al.，2012; Hakata et al.，2017）。对于TIFY 的保守基序，TIFY8仅含有TIFY，此外，其成员TIFY8、 TIFY9、TIFY10、 TIFY12、 TIFY13、 TIFY14、 TIFY15、TIFY18和TIFY19 缺少了JAS-domin，这些具有特殊结构的成员可能在茶树的进化中具有独特性（赵晓晓等，2019）。

茶树CsTIFYs启动子与激素、胁迫相关的作用元件占主导地位，但不同基因作用元件的种类和个数均不同（Xie et al.，219），随着激素种类和程度的改变，茶树 CsTIFYs 基因响应发生改变，进而导致其功能差异性。此外，部分基因含有不同的胁迫响应元件[低温响应元件（Box 4、LTR）、干旱响应元件（Box 4、GATA-motif、 W box和AT-rich element）、盐响应元件（GATA-motif、W box和AT-rich element）、激素响应元件（ARE、Box 4、CGTCA-motif、TGACG-motif、ABRE、AAGAA-motif）及逆境响应元件（MYB、G-Box、MYC和 STRE）等]，推测 CsTIFY可能参与不同激素信号转导调节，从而对环境胁迫作出应答。为了更好地了解茶树CsTIFYs基因的表达差异，本研究对 CsTIFYs 在不同组织的基因表达进行分析，结果发现茶树TIFY1基因对不同胁迫不同时间段表达量都很高，只有在PEG-6000和盐胁迫下，TIFY1随时间的增减表达量降低，TIFY1、TIFY2、TIFY3、TIFY6、TIFY11、TIFY12、TIFY14和 TIFY16激素处理高表达，而TIFY5和 TIFY7对胁迫在不同的时间段有负调控或不调控; TIFY6在激素、盐和干旱胁迫下表达量最高，而在冷胁迫下表达微弱。茶树CsTIFYs 基因在不同组织均存在表达差异性，推测 CsTIFYs 在基因调控上也存在一定的差异。同时，本研究筛选了在不处理下表达量高的TIFY家族成员进行RT-qPCR验证胁迫处理下TIFY基因的表达情况，结果表明，7个TIFY家族成员对激素以及非胁迫有较强的反应。在激素处理12 h时，TIFY6基因的表达是TIFY15的8.5倍，是TIFY8的 8.7倍; 在冷处理48 h，TIFY6表达量达到最高，是TIFY1的3.2倍; 干旱处理48 h，TIFY6的表达量最高，为7.42，是TIFY8的11倍; 盐处理48 h时基因表达量最高，TIFY6为11.4，TIFY1为8.64，可知TIFY6基因在不同处理的不同时间段基因的表达差异性显著。因此，TIFY6基因可作为茶树在受到外界胁迫时的候选基因。

总之，茶树TIFY家族成员，通过生物信息学分析，进一步确定了茶树TIFY基因家族的分类和进化关系。同时，分析TIFY 基因家族的启动子顺式作用元件、表达模式以及外源激素处理和非生物胁迫处理下的表达特性，初步探究了TIFY基因家族参与胁迫应答和激素调控等茶树的生长发育，同时，本研究把TIFY6基因列为调控不同环境条件下逆境变化的候选基因，为进一步研究茶树TIFY基因家族生物的功能提供了一定的研究方向和基础。

参考文献