花生（Arachis hypogaea）是我国重要的油料和经济作物，是主要的食用植物油来源。在我国，花生产区可分为南方产区和北方产区。但是南方地区的土壤多为酸性土壤，pH值在4.5~6.0之间，Al₂O₃含量高，交换性Al³⁺占阳离子交换量的20%~80%（李庆逵，1983）。当pH低于5.0时，铝以有毒的形态存在来引起作物毒害，故酸雨和铝毒被认为是南方地区农作物生长重要的限制因子之一（李学垣等，1995）。在我国，南方产区花生产量低于全国平均水平，与北方产区相比仍然存在较大的差距（鲁清等，2017），故通过阐明花生受铝毒害的机制，进而选育耐铝性品种来提高南方花生生产力愈发重要。研究表明花生受铝毒害的部位主要是根尖，表现为根系生长受抑制、线粒体功能受损、ROS迸发以及发生细胞程序性死亡等（詹洁等，2008；徐芬芬等，2014；Huang et al.，2014）。花生响应铝毒害的机制主要包括外部排斥和内部耐受两种，这两种机制中需要众多成员参与来传递信号，发挥功能，最终使得花生响应铝毒害。

类受体蛋白激酶（receptor-like protein kinases，RLKs）是一种由胞外域接收信号，后通过激酶域传递和激活下游信号通路完成胞内外信号转导的酶活性受体（马媛媛等，2005），在植物中广泛存在，并可分为多个家族（Shiu &Bleecker，2001a，b），参与众多生长代谢过程的调控，如参与植物的生长发育进程（Nibau &Cheung，2011）、植物对病虫害防御应答（Yang &Ramonell，2012）和植物抵抗非生物胁迫（Osakabe et al.，2010）等。PRKs蛋白是一类富含亮氨酸重复序列（LRR）的RLK蛋白（Duckney et al.，2017），首个PRK激酶是在矮牵牛中被发现，命名为PRK1，特异性分布在花粉中，并在减数分裂中发挥作用（Mu et al.，1994）。拟南芥中的6个PRK成员也在花粉中高表达，并命名为AtPRK1-6（Chang et al.，2013）。研究发现，PRKs在花粉管发育（Chang et al.，2013；Duckney et al.，2017）、信号转导（Huang et al.，2014）和细胞死亡（Wrzaczek et al.，2014）等方面发挥了重要的调控作用，但关于PRKs在胁迫中的功能研究很少，仅在拟南芥的低水势胁迫下研究发现，相较于野生型，突变体prk1会积累更多的脯氨酸来响应胁迫（Verslues et al.，2014），而PRKs在铝胁迫下是否有响应还未见报道。

RLKs通过磷酸化作用传递信号进而响应胁迫。在冷胁迫下，激酶OST1（OPEN STOMATA 1）活性被激活，通过磷酸化ICE1（Inducer of CBF expression 1）来增加该转录因子的蛋白稳定性和转录活性，进而增强拟南芥对低温的抵抗能力（Ding et al.，2015）。CIPK26（CBL-interacting protein kinase26）与RBOHF（respiratory burst oxidase homolog F）的N端存在相互作用，并且可磷酸化RBOHF来刺激ROS产生，进而影响RBOHF在植物胁迫应答中的调控（Drerup et al.，2013）。SOBIR1（suppressorn of BIR1-1）激酶依赖于其蛋白浓度发生自磷酸化，其第529位的苏氨酸以及β3-αC环结构对磷酸化至关重要，并影响SOBIR1对烟草细胞死亡的调控（Wei et al.，2022）。拟南芥CPK28（calcium-dependent protein kinase28）可响应拟南芥Ca²⁺信号路径参与免疫反应和生长发育调控，研究发现CPK28具自磷酸化活性，并随着Ca²⁺浓度增加而活性增强，其中第318位丝氨酸是关键活性位点，尽管该位点突变不会影响CPK28调控营养生长和生殖生长时期的转换，却会对AtPep1引发的氧化应激表现高敏性状，同时对丁香假单胞菌具有更强的抵抗力（Bredow et al.，2021）。这表明RLKs的磷酸化活性与这些蛋白在植物胁迫应答中的作用密切相关。

通过对实验室已有转录组数据的挖掘（Xiao et al.，2021），我们发现花粉类受体蛋白激酶基因AhPRK4转录受铝胁迫处理的诱导，并且在不同花生铝耐性品种中有着不同的响应模式，暗示其参与花生铝胁迫响应过程。本研究以AhPRK4的铝胁迫响应模式和蛋白活性为研究内容，采用qRT-PCR检测了不同铝浓度和处理时间条件下，AhPRK4在花生耐铝品种‘99-1507’和铝敏感品种‘中花2号’（‘ZH2’）的转录变化，对AhPRK4胞内域进行克隆，并开展了原核表达分析，通过磷酸化抗体对其自磷酸化活性进行检测，拟探讨以下问题：（1）AhPRK4的铝响应模式；（2）AhPRK4胞内域的磷酸化状态。为后续在蛋白质水平上探究AhPRK4蛋白的生化功能以及在铝胁迫下的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试花生品种由中国农业科学院油料作物研究所提供，并经实验室早期筛选鉴定出的铝敏感品种‘中花2号’（‘ZH2’）和耐铝品种‘99-1507’（詹洁等，2008）。将花生种子经湿润珍珠岩催芽3 d后，去除花生种皮并掐除约1 cm的主根根尖，在26℃条件下将材料置于改良的Hoagland营养液中培养至第三片真叶长出，转移花生幼苗至100 μmol·L^-1 CaCl₂溶液（pH 4.2）中培养24 h，之后做以下两种处理：一是用100 μmol·L^-1 AlCl₃溶液（含100 μmol·L^-1 CaCl₂，pH 4.2）分别处理花生幼苗4、8、12、24 h；二是用不同浓度的AlCl₃溶液（50、100、200、400 μmol·L^-1）分别处理花生幼苗4 h和8 h。以上两种处理均以改良的Hoagland营养液处理作为对照，取约1 cm的根尖作为实验材料。

1.2 RNA提取

先参照植物总RNA提取试剂盒（Promega）方法提取RNA，之后参照反转录试剂盒（Takara）方法进行RNA反转录，获得cDNA。

1.3 AhPRK4在铝胁迫下表达量检测

根据AhPRK4基因CDS（coding sequence）序列设计荧光定量PCR检测引物（表1），参照TB Green Premix Ex Tap II酶（Takara）说明，设置qRT-PCR反应体系和程序，以UBQ10R为内参，采用2^-△△Ct法进行基因相对表达量的分析。

1.4 生物信息学分析

利用在线网站ProtParam tool预测AhPRK4的分子量、等电点等理化性质（https://web.expasy.org/protparam/）；通过WoLF PSORT来预测其亚细胞定位（https://wolfpsort.hgc.jp/）；通过NCBI比对获得其他物种对应的基因序列，利用MEGA 7.0构建进化树，并在软件DNAMAN进行多序列比对，同时通过NCBI Conserved Domain预测AhPRK4蛋白的保守结构域（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。对于目的蛋白的跨膜域以及信号肽分析分别通过在线网站TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 4.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）完成，同时对AhPRK4的磷酸化位点以及互作蛋白进行了预测，磷酸化预测软件为iGPS 1.0，互作蛋白预测网站为STRING（https://stringdb.org/cgi/input.pl?sessionId=K7gDcPsKo9E0&input_page_active_form=single_sequence）。AhPRK4启动子元件预测于PlantCARE在线网站进行（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。

1.5 AhPRK4激酶域克隆和原核表达载体构建

从NCBI上搜索得到AhPRK4的基因序列，运用软件PrimerPremier 5设计激酶域克隆引物（表1）。以‘ZH2’根尖cDNA为模板，克隆获得AhPRK4的胞内激酶域，参照ClonExpressll One Cloning Kit试剂盒方法连接AhPRK4-CD至pGEX-6p-1载体（双酶切位点为EcoR I和Xhol），热激转化至DH5α，将经过测序验证正确的阳性克隆菌株提取质粒（AhPRK4-CD-pGEX-6p-1）。

1.6 AhPRK4蛋白的原核表达和纯化

将AhPRK4-CD-pGEX-6p-1重组质粒转化至Rosetta感受态细胞，37℃培养至 OD₆₀₀=0.6~0.8，加入终浓度为0.5 mmol·L^-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在16℃下诱导GST-AhPRK4-CD蛋白表达，经SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况。参考Glutathione Sepharose4B填料（GE公司）说明纯化AhPRK4-CD重组蛋白，并进行Western Blot验证。

1.7 GST-AhPRK4-CD自磷酸化检测

加0.5 μg的GST-AhPRK4-CD蛋白到100 μL PBS磷酸缓冲液（含25 mmol·L^-1 Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol·L^-1 MgCl₂，10 mmol·L^-1 MnCl₂，1 mmol·L^-1 DTT，1×蛋白酶抑制剂和1 mg·mL^-1 ATP）中，以不加ATP为对照组，混合液于28℃下孵育10 min，并于100℃下孵育10 min变性，后取30 μL样品经12% SDS-PAGE分离，并转膜依次用兔抗的酪氨酸磷酸化抗体（Cell Signaling公司）、苏氨酸磷酸化抗体（Cell Signaling公司）以及鼠抗的GST抗体（康为世纪公司）孵育并化学显色，根据对照组和处理组条带差异判断磷酸化及激酶活性。

2 结果与分析

2.1 AhPRK4在不同铝处理时间、浓度下的表达

由图1：A可知，‘ZH2’和‘99-1507’经铝处理不同时间后，与对照相比，AhPRK4的表达量均上升，但两个花生品种中AhPRK4的表达趋势有所差异，‘ZH2’中，AhPRK4在4 h的表达量最高，8 h的表达量最低，随后表达量则一直增加。‘99-1507’中，AhPRK4表达量则先增加后降低，在12 h达到最高。由图1：B，C可知，在经不同铝浓度处理4 h和8 h后，发现在两个花生品种中AhPRK4的表达量随着处理浓度的增加同样呈先增加后降低的趋势；且在不同铝浓度处理8 h时，AhPRK4在耐铝性品种‘99-1507’中的响应比敏感性品种‘ZH2’更剧烈。综上所述，这些结果表明AhPRK4是铝胁迫响应基因。

2.2 AhPRK4的生物信息学分析

2.2.1 AhPRK4蛋白理化性质、结构特征及亲缘关系的分析

分析AhPRK4（LOC112718333）的序列信息可知，该基因CDS（coding sequence）全长为2 022 bp，编码673个氨基酸。经预测该蛋白质分子量为74.92 kD，理论等电点为6.06； AhPRK4蛋白N端具多个亮氨酸重复结构域，C端具丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶结构域，激酶域含有ATP结合位点，并与其他物种PRK成员的激酶域具较高的同源性（图2）；AhPRK4蛋白含有两个跨膜域，属于膜功能蛋白。因此，AhPRK4蛋白属于具有跨膜域和信号肽的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

进化树构建结果显示AhPRK4独立成一个分支，与比对的9个物种之间有较大的差异； 拟南芥中，AhPRK4与AtPRK1和AtPRK4有较高的同源性（图3）。进一步查询花生LRR-RLK家族分类，AhPRK4属于LRR-III蛋白激酶家族（Wang et al.，2021）。经预测AhPRK4具可磷酸化的氨基酸位点，包括丝氨酸（S）和苏氨酸（T）。因此，AhPRK4可能与AtPRK1和AtPRK4具相近的功能，可能发生磷酸化。

2.2.2 AhPRK4启动子分析和互作蛋白预测

经花生基因组序列提取，得到AhPRK4基因ATG前长2 000 bp的启动子序列。分析启动子元件，结果表明：AhPRK4的启动子元件包括生长素响应元件、ABA响应元件、 MeJA响应元件等激素响应元件，光调控元件，干旱胁迫响应元件和60 K蛋白结合位点（图4：A）。以拟南芥数据库为筛选基础，筛选AhPRK4的相互作用蛋白，发现AhPRK4可与多个蛋白存在互作，包括LMK1（leucine-rich repeat receptor-like kinase with extracellular malectin-like domain 1）、 ABCB16 （ATP-binding cassette B16）、PME30（pectin methylesterase30）、激酶AT1G34420（leucine-rich repeat transmembrane protein kinase family protein）、HAK1（HDS-associated RLK1）、PEPR2（PEP1 receptor 2）、AT1G12460（leucine-rich repeat protein kinase family protein）、AT1G24650（leucine-rich repeat protein kinase family protein）、FEI1、AT1G49100（leucine-rich repeat protein kinase family protein）（图4：B），推测AhPRK4可能参与激素调控、细胞死亡、非生物胁迫应答、生物防御、细胞壁膨大等调控过程。

2.3 AhPRK4激酶域克隆和原核表达载体构建

以‘ZH2’根尖cDNA为模板，克隆到AhPRK4胞内域片段（AhPRK4-CD）（图5：A），序列长度为1 122 bp，与目的片段（LOC107470884）序列100%同源。连接AhPRK4-CD片段和pGEX-6p-1载体，获得重组质粒（AhPRK4-CD-pGEX-6p-1）（图5：B）。

2.4 重组蛋白诱导表达和纯化

将含有AhPRK4-CD-pGEX-6p-1重组质粒的Rosetta菌株在16℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG环境中培养，在约71 kD处发现诱导后的上清液中有加深的特异性条带，表明其以可溶性的形式存在于上清液中（图6）。GST-AhPRK4-CD重组蛋白用Glutathione Sepharose4B填料纯化，在结合后用PBS洗脱无明显条带（图7：A），表明层析柱与GST-AhPRK4-CD重组蛋白结合较好，后经Elution buffer洗脱后获得了条带单一且位置正确的目的条带，表明GST-AhPRK4-CD重组蛋白已成功纯化。将获得的GST-AhPRK4-CD纯化蛋白根据携带的标签蛋白经特异性GST一抗孵育，进行Western Blot验证，可以发现在约71 kD处出现清晰的特异性目的条带（图7：B），表明GST-AhPRK4-CD重组蛋白纯化效果较好。

2.5 重组蛋白体外磷酸化检测

将纯化的GST-AhPRK4-CD蛋白进行体外磷酸化实验，用磷酸化抗体检测磷酸化水平，用GST抗体标定上样水平。由图8可知，两个磷酸化抗体孵育后，均能在目标蛋白位置处检测到条带，磷酸化苏氨酸抗体（anti-pT）有着更强的磷酸化信号，磷酸化酪氨酸抗体（anti-pY）信号较弱，表明该蛋白在原核诱导的过程中已经发生了磷酸化修饰。但与对照组相比，ATP处理并未使得条带有加深的现象（图8），暗示AhPRK4-CD蛋白不存在体外自磷酸化活性。

3 讨论与结论

目前对PRK家族在胁迫应答机理的研究还未见系统的报道，仅在拟南芥突变体prk1缺水处理下发现，相较野生型来说，该突变体会积累3.2倍的脯氨酸来响应低水量胁迫（Verslues et al.，2014）。前人研究也表明随着铝处理浓度的增加和铝处理时间的延长，花生根系游离脯氨酸的含量整体呈递增的趋势（徐芬芬等，2014）。本研究在对铝处理下花生根尖AhPRK4转录水平的检测中也发现AhPRK4是一个铝胁迫响应基因，进一步分析AhPRK4的表达水平发现其在两个铝耐性不同的花生品种中的表达模式不同，在不同铝浓度处理下，AhPRK4表达水平均显著提高，在铝处理8 h后，在耐铝品种‘99-1507’中的表达上调更强烈，暗示AhPRK4是花生耐铝相关基因，在铝胁迫下，AhPRK4是否与AtPRK1功能类似而与应激脯氨酸之间有关联？有待进一步研究。

AhPRK4蛋白与其他物种的PRK成员的激酶域具有较高的同源性，表明此结构域在不同物种PRK以及同一物种不同PRK 成员的保守性。系统进化树中，AhPRK4与AtPRK4以及AtPRK1在同一大分支上，具有较近的亲缘关系，其中AtPRK4与AtNET2A互作共同参与微管运动来调控花粉管发育（Duckney et al.，2017）， AtPRK1可在水势胁迫下通过脯氨酸响应胁迫（Verslues et al.，2014），故AhPRK4也可能参与花粉管发育和响应胁迫中。以AhPRK4的拟南芥同源蛋白AtPRK4的序列在拟南芥数据库中筛选预测AhPRK4的互作蛋白，发现互作蛋白中以各类型激酶最多，同时预测AhPRK4具有磷酸化位点，故AhPRK4可能以磷酸化与各类型激酶之间形成调控网络。在预测的互作蛋白中，部分蛋白功能已有报道，其中LMK1调控叶片死亡（Li et al.，2020），HAK1可与PBL27蛋白互作参与HDS（herbivore-derived danger）防御反应（Uemura et al.，2020），PEPR2参与BSCTV（beet severe curly top virus）病害防御（Zeng et al.，2020），推测AhPRK4在胁迫防御中起作用，进一步验证其互作蛋白对探究AhPRK4在铝胁迫中的响应机制具有重要意义。除此之外，本研究对AhPRK4基因的启动子元件进行预测，发现该基因启动子区域含有生长素和ABA响应元件。生长素在植物铝胁迫响应信号传递途径中发挥作用，铝胁迫下植物的生长素在根尖的细胞分布和在细胞的运输可能会受到影响，进而导致根长受到抑制（吴道铭等，2014）；除生长素外，在大豆铝胁迫与ABA实验中也发现，大豆根尖内源ABA与铝处理时间和铝处理浓度呈正相关关系，并且ABA处理可减少铝胁迫下的氧化伤害（侯宁宁，2009）。故ABA和生长素是否也调控花生铝胁迫？有待进一步研究。

AhPRK4属于LRR-III类受体蛋白激酶家族的成员之一，具丝氨酸/苏氨酸激酶域，并经预测具有磷酸化位点，为了验证AhPRK4是否可发生磷酸化及探究AhPRK4的活性，本研究采用原核表达和亲和柱层析的方法获得AhPRK4-CD重组蛋白来探究其生物功能，在蛋白诱导过程中，16℃条件下可获得较好的诱导效果。本研究已成功诱导并纯化得到GST-AhPRK4-CD重组蛋白，体外磷酸化抗体孵育检测AhPRK4-CD重组蛋白可以发生磷酸化修饰，但在酪氨酸位点的磷酸化修饰水平极低，由于我们使用的磷酸化苏氨酸抗体（Cell Signaling Technology，9381）对磷酸化丝氨酸残基也有一定的识别能力，所以我们认为AhPRK4-CD的磷酸化修饰主要发生在丝/苏氨酸残基上。在本研究中，我们未检测到AhPRK4-CD的自磷酸化活性，一方面，可能是AhPRK4蛋白的自磷酸化活性较低，需要采用更灵敏的检测手段，如同位素标记等方法来进行检测；另一方面，AhPRK4也可能是一种需要被其他因子磷酸化来共同发挥作用的辅助蛋白，仍需要进一步实验探究。

综上所述，AhPRK4为铝胁迫应答基因，该基因启动子区域含有胁迫激素应答元件，预测的互作蛋白也可在胁迫下起作用。在此基础上，采用原核表达的技术成功诱导得到AhPRK4-CD纯化蛋白，并验证其可以发生磷酸化修饰，为探究该蛋白在花生铝胁迫中的调控功能奠定了基础。

参考文献