叶绿体（chloroplast，cp）是绿色植物进行光合作用的场所，也是绿色植物所特有的细胞器。叶绿体具有相对自主的遗传系统，有自己的遗传物质，能够进行半自主的复制（Xue et al.，2019）。在高等植物中，大多数植物的叶绿体基因组包括一个大单拷贝区（large single copy，LSC）、一个小单拷贝区（small single copy，SSC）和两个反向的重复区（inverted repeats，IRs）（Li et al.，2013）。叶绿体基因组按功能可分为参与叶绿体生物合成的基因、参与叶绿体基因表达的基因、参与光合作用的基因和一些功能未知的开放阅读框（孙志轩等，2022）。叶绿体拥有简单的基因组结构，它包含大量的遗传信息，基因组内碱基交换的速度处于中间水平，分子进化速度在编码区和非编码区的差别很大，所以叶绿体基因组也被广泛利用在系统发育推断和群体遗传学等领域（赵玉芬等，2022）。近年来，随着高通量测序技术越发成熟，近6 000个物种的叶绿体基因组成功被组装和注释。目前，叶绿体基因组分析已经涵盖了大部分被子植物，例如姜科（Zingiberaceae）（Liew et al.，2022）、兰科（Orchidaceae）（Xie et al.，2022）、石竹属（Dianthus）（Lin et al.，2022）等，这些分析为研究物种变异、物种遗传和系统发育关系等方面做出了卓越的贡献。

桃金娘科（Myrtaceae）主要分布于热带和近热带地区，多为乔木或者灌木，约有150属5 600种，我国现有近100种。蒲桃属（Syzygium）是桃金娘科下的一个重要属，全世界约有500种，中国约有72种（陈介，2007）。因为蒲桃属植物外形美观，抗逆性强，所以大多用于城市绿化，但随着近年研究的深入，蒲桃属中的轮叶蒲桃、蒲桃和洋蒲桃等也被发掘出了药用价值。轮叶蒲桃根和叶可用于祛风散寒，活血化瘀，治疗跌打损伤、伤风感冒和风湿性头痛，具有巨大的开发利用价值（罗德志等，2020）。目前，在蒲桃属中，仅有8个物种通过高通量测序获得了完整的叶绿体基因组，学者们对蒲桃属的主要研究重点包括植物化学成分的分离鉴定以及药物研发等方面。一些学者也探讨过桃金娘科的系统发育关系，但只停留于系统发育分析（王雪芹等，2021）。在蒲桃属中，仅有肖蒲桃的叶绿体基因组被详细分析过，但包括轮叶蒲桃在内的其余物种的叶绿体基因组特征和系统发育相关分析等方面的研究成果则尚未见详细报告。

本文首次对轮叶蒲桃进行测序，并对测序结果进行组装分析。分析内容涵盖了基因组结构、功能及特征、重复序列、SSR分析和系统发育分析等多方面，并且首次对轮叶蒲桃及其亲缘物种进行对比分析，对其物种间遗传变异做出了阐述。轮叶蒲桃开发前景较好，叶绿体基因组资源可以为其物种进化提供有效信息，但轮叶蒲桃叶绿体基因组特征和相关系统发育关系尚未有相关报道，影响了其进一步开发利用。本研究通过使用高通量测序技术对轮叶蒲桃的叶绿体基因组进行解码，并以已发表的密切相关物种肖蒲桃的叶绿体基因组序列作为参考进行拼接，得到完整的轮叶蒲桃叶绿体基因组，并在此基础上进行分析，解析轮叶蒲桃与其他桃金娘科植物的系统发育关系，为轮叶蒲桃在个体发育过程中存在的遗传和变异问题及其开发和系统研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料、测序和组装

轮叶蒲桃材料采集于福建龙海，用液氮冷冻处理后交与安诺优达生物技术有限公司，在Illumina NovaSeq 6 000平台上测序（中国浙江），测序共获得4.8 G数据量，测序读长为PE 150。通过GetOrganelle（v 1.6.2）进行数据组装（Jin et al.，2020）。组装后用在线软件CPGAVAS 2（http://47.96.249.172:16019/analyzer/view）进行注释（Liu et al.，2012），使用Geneious（v 9.0.2）进行人工校正。测序产生的原始数据（Submission ID: SUB11257174; BioProject ID: PRJNA826323）和组装完成的叶绿体基因组信息（GenBank accession number: ON243764）均上传至NCBI数据库。

1.2 叶绿体基因组结构、功能分析

通过在线软件CPGAVAS2（http://47.96.249.172:16019/analyzer/view）注释轮叶蒲桃叶绿体基因组后，根据注释信息，用Geneious（v 9.0.2）对轮叶蒲桃叶绿体基因组进行基因组成和基因功能分析（穆雨农，2020）。通过在线软件OGDRAW（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）绘制轮叶蒲桃叶绿体基因组的物理图谱（Lohse et al.，2009）。

1.3 重复序列和SSR位点分析

使用在线软件REPuter（Kurtz et al.，2001）（https：//bibiserv.cebitec. uni-bielefeld）对轮叶蒲桃叶绿体基因组重复序列进行分析，其中包括同向、反向、互补和回文重复。软件的参数设置如下：重复序列数目上限为1 000，最小重复长度为30，汉明距离为3（表示一对重复序列的相似度不能小于90%），编辑距离为默认参数。

通过在线软件MISA（v 2.1）检测轮叶蒲桃叶绿体基因组的简单重复序列（Beier et al.，2017）。参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重复次数分别设置为10、5、4、3、3、3，其余均为默认。得到的结果文件用Krait（v1.3.3）软件进行手动修正（Du et al.，2018）。

1.4 密码子偏好性分析

通过CodonW（v 1.4.2）软件对轮叶蒲桃叶绿体基因组进行密码子偏好性分析。为了减少误差，本研究选择的蛋白质编码区长度≥300 bp，并且计算出了轮叶蒲桃叶绿体蛋白编码基因的相对同义密码子使用度RSCU值（relative synonymous codon usage），参数均为初始默认值。

1.5 基因组的比较分析

使用在线网站JSHYCloud（http://cloud.genepioneer.com:9929）比较轮叶蒲桃与4个近缘物种，即白果蒲桃（Syzygium album）、马六甲蒲桃（S. malaccense）、香蒲桃（S. odoratum）和肖蒲桃（S. acuminatissimum）的IR边界（LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC）信息。

通过在线软件mVISTA（https://genome.lbl.gov/vista/index.shtml）中的Shuffle-LAGAN模型比较轮叶蒲桃与以上4个近缘物种基因组序列差异（Frazer et al.，2004）。

通过Geneious（v 9.0.2）对轮叶蒲桃及4个近缘种进行MAFFT比对（陈韵等，2017），再使用DnaSP（DNA Sequence Polymorphism）进行核酸变异度分析（Librado &Rozas，2009），滑动窗口长度为600 sites，步长为200 sites，其余所有参数均为默认，得出P_i值。

1.6 系统发育分析

为阐明轮叶蒲桃与桃金娘科其他物种的系统发育关系，从GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）中下载了桃金娘科22个物种的叶绿体基因组序列，采用Geneious（v 9.0.2）软件（MAFFT插件）比对23种叶绿体基因组全序列。使用RAxML（v 8.2.12）构建最大似然进化树，最佳模型为GTR+F+R2，bootstrap值设置为1 000，以推断各节点的支持率。

2 结果与分析

2.1 叶绿体基因组结构、功能及特征

轮叶蒲桃叶绿体基因组全长158 591 bp（图1），共编码129个基因，其中包括8个rRNA基因，37个tRNA基因，84个蛋白编码基因。轮叶蒲桃叶绿体基因组为环状。其中，大单拷贝区的长度为88 046 bp，GC含量为34.8%；小单拷贝区长度为18 409 bp，GC含量为30.9%；单个反向重复区的长度为26 068 bp，GC含量为42.7%，明显高于LSC区和SSC区。在轮叶蒲桃叶绿体基因组中，总GC含量为37.0%，低于AT（63.0%）含量。由图2可知，白色、灰色和黑色区域为外显子，箭头表示基因的方向。轮叶蒲桃包含了3个外显子，其中两个外显子因在反向重复区而分别具有2个拷贝，5′端位于LSC区，3′端位于IR区。此外，轮叶蒲桃叶绿体基因组中有22个含有内含子的基因，其中在19个基因中发现1个内含子，另外3个基因中发现有两个内含子（表1）。其中，rps12作为一种反式剪切基因。

2.2 重复序列和SSR分析

在轮叶蒲桃叶绿体基因组中可以检测到39个大小为30~45 bp的重复序列，包含了1个反向重复，19个回文重复及19个同向重复，未检测到互补重复（图3）。这些重复序列分布广泛，有18个（包含9个同向重复，9个回文重复）位于ycf2、psaB、psaA、trnS-GCU、trnS-UGA、ycf1基因上，9个跨区域，8个位于基因间区（IGS，intergenic spacer），4个位于内含子区域，4个最长的重复序列（45 bp）全部位于ycf2基因上。

在轮叶蒲桃叶绿体基因组中共检测到84个SSR位点，平均长度（SSR总长度/SSR总计数）为11.34 bp。其中，单核甘酸60个，二核苷酸2个，三核苷酸8个，四核苷酸13个，五核苷酸1个。此外，轮叶蒲桃叶绿体基因组中大部分SSR位点位于IGS区域（64个），少部分位于基因上（20个）。叶绿体中两个二核苷酸（TA、TC），长度均为10 bp，三核苷酸的长度均为12 bp，四核苷酸重复长度仅有一个为16 bp，其余均为12 bp，唯一的五核苷酸长度为15 bp。

2.3 密码子偏好性分析

对轮叶蒲桃叶绿体基因组的41个大于300 bp的蛋白质编码序列进行密码子偏好性分析（表2）。轮叶蒲桃叶绿体基因密码子中，RSCU值＞1的密码子有30个，RSCU最高值为1.98，为亮氨酸中的UUA，最低值为0.33，为亮氨酸中的CUG。其中，有29个以A/U结尾，说明轮叶蒲桃叶绿体基因组密码子更偏向以A/U结尾。轮叶蒲桃叶绿体基因的密码子总数为17 506个，其中1 846个（10.54%）为编码亮氨酸的密码子，仅有195个（1.11%）密码子编码半胱氨酸，表明在轮叶蒲桃叶绿体基因组中使用最多的是亮氨酸，使用最少的是半胱氨酸。在所有密码子中，异亮氨酸中的AUU使用次数最多，次数为786，使用次数最少的是半胱氨酸中的UGC，次数为44。

2.4 叶绿体基因组的比较分析

通过在线网站JSHYCloud比较分析了蒲桃属5个物种的LSC、SSC和IR区的边界位置。结果表明这5个物种的IR区长度较保守（26 068~26 472 bp）。结果如图4所示，5个物种LSC/IRb边界在rps19基因内部，并且扩张程度均一致。轮叶蒲桃和马六甲蒲桃的ndhF基因紧挨着IRb/SSC边界，而白果蒲桃、香蒲桃和肖蒲桃的ndhF基因距边界为53~58 bp。5个物种的SSC/IRa边界都位于ycf1基因上，轮叶蒲桃和马六甲蒲桃的ycf1基因朝SSC区分别进入了4 851 bp和4 857 bp，朝IRa区进入了750 bp。白果蒲桃、香蒲桃和肖蒲桃均有4 857 bp位于SSC区、1 188 bp位于IRa区。

图5结果显示（灰色箭头表示基因的方向，纵坐标表示从50%到100%的一致度；UTR表示非翻译区，CNS表示保守非编码序列），以白果蒲桃为参照序列，轮叶蒲桃的基因组与另外4种植物叶绿体基因组之间有所区别。在变异较大的LSC和SSC区，轮叶蒲桃的变异度较另外4种而言较大。5个物种的IR区较为保守，LSC和SSC区中psbM-psbD、psbZ-trnM（CAT）、trnM（CAT）-atpE、ycf4-psbE、ndhF-ccsA基因之间存在较大的序列差异。

使用DnaSP软件进行分析且经过MAFFT比对后的5种桃金娘科植物叶绿体基因组序列结果如图6所示， X轴表示核苷酸的位置， Y轴表示每个窗口的核苷酸多样性，可显著发现IR区的变异度比LSC和SSC区更低。P_i值最高点为0.015，位于LSC区的psbZ-psaB基因间区。图中有2处P_i=0.015的热点，45处0.010＜P_i＜0.015，可以看出核苷酸多样性水平较高。

注：*表示有一个内含子的基因； **表示有两个内含子的基因；括号内的数字表示多拷贝基因的拷贝数量。

Note: *indicates the gene with one intron; **indicates the gene with two introns; the number in parentheses indicates number of copies of a multi-copy gene.

2.5 系统发育分析

结果如图7所示，分支上的数字为1 000次自展支持率。系统发育树中具有20个支持率为100%的拓扑结构节点，遗传变异度为0.01，可信度比较高。蒲桃属、桉属（Eucalyptus）、伞房桉属（Corymbia）和杯果木属（Angophora）亲缘关系较近。在蒲桃属中，轮叶蒲桃与滇边蒲桃和乌墨亲缘关系最近，其次是蒲桃。

3 讨论与结论

轮叶蒲桃叶绿体基因组全长158 591 bp，总GC含量为37.0%，与已发表的桃金娘科物种叶绿体基因组（王雪芹等，2021）相似。轮叶蒲桃完整叶绿体基因组对A/T具有偏好性（推测可能是因为A/T比G/C更容易解链）（左文明等，2019；赵祺等，2021）。另外，轮叶蒲桃完整叶绿体基因组中有129个基因被编码，这些基因中含有蛋白编码基因84个和tRNA基因37个，与邓演文等（2021）的研究结果一致，表明轮叶蒲桃叶绿体基因组相对保守。可以根据这一性状推测出易变性存在于轮叶蒲桃叶绿体基因组序列，并且易发生变异。

有研究者发现，重复序列分析对于分析叶绿体的基因重排、碱基替换、系统发育和基因组进化有重要的作用（Smith et al.，2002; Nie et al.，2012）。轮叶蒲桃叶绿体基因组中包含了3种重复序列类型，大部分位于基因上，其中，最大的四个重复序列均位于ycf2基因上。在轮叶蒲桃的叶绿体基因组中检测到84个SSR位点，随着基序长度的增加，SSR的频率降低，具有多态性。SSR多态性是由重复单元的伸长或缩短引起，广泛用于种群遗传多样性或种群分类分析（Xu et al.，2004; Zhao et al.，2019）。轮叶蒲桃的单核苷酸均为A/T型，与蒲桃属的肖蒲桃一致（邓演文等，2021）。由前人研究可知，从叶绿体基因组中鉴定出的重复序列和SSR可以作为未来木材生态学、进化和追踪研究的宝贵标记（申响保等，2021；梁燕妮等，2022）。

叶绿体基因对于密码子的使用普遍具有偏好性，而通过密码子的偏好性能反映物种对外界环境的选择压力，在叶绿体基因组的研究中发挥着重要作用（Morton et al.，1999; Asaf et al.，2017）。轮叶蒲桃叶绿体基因组中编码亮氨酸的密码子（1 846，10.54%）使用的频率最多，编码半胱氨酸的密码子（195，1.11%）使用的频率最少。分析表明，轮叶蒲桃密码子具有很强的A/U碱基偏性，与睡莲、木兰等（季凯凯等，2020; 黄祥等，2022）被子植物一致。这说明在被子植物间密码子偏好性具有相似性，这种相似性的产生或许与自然选择、遗传变异或者其他方面有关系。

虽然蒲桃属植物叶绿体基因组的部分特征与其他被子植物基本一致（王玲等，2012），但是轮叶蒲桃和蒲桃属其他物种之间亲缘关系的远近尚不明确。蒲桃属的5个物种边界处的基因种类比较保守。由分析可看出，轮叶蒲桃与白果蒲桃的边界区域比较相似，可能是具有较为接近的起源时间（王一麾等，2022）。IR区的收缩和扩张广泛存在于5个蒲桃属植物中，进行进一步的评估可以揭示轮叶蒲桃及相关类群的进化演变过程。

在全序列比对分析中，参试的5个蒲桃属物种间具有较高的相似性，同时也存在几个变异较大的区域，这些区域的差异位点可以应用于种质资源的鉴定、DNA条形码的开发以及后续其他研究（Kim et al.，2004）。从核苷酸多样性分析可以看出，变异位点的P_i值位于0.00 067~0.015之间，有较高水平的核苷酸多样性，LSC区和SSC区是轮叶蒲桃叶绿体基因组中会发生高频变异的区域，这些区间可以作为进化分析的区域（Park et al.，2019），有助于研究轮叶蒲桃的种间关系。

注：带下划线所对应的密码子表示被高频使用的密码子（RSCU＞1）。

Note: The underlined codon indicates a high frequency codon (RSCU＞1) .

本研究从NCBI已公开的植物中选取了包括轮叶蒲桃在内的23种植物，通过系统进化分析确定了轮叶蒲桃的进化地位和亲缘关系。轮叶蒲桃、蒲桃、滇边蒲桃和乌墨构成了一个支持率高的单支，与马六甲蒲桃的关系比较密切，亲缘关系较近。在中国植物志分类系统中，轮叶蒲桃、滇边蒲桃和乌墨属小花蒲桃组，这与本研究中构建的系统发育树一致，表明该文聚类分析结果具有可靠性。虽然蒲桃属物种组成丰富，但是目前所有的系统发育数据较少，轮叶蒲桃系统发育关系的研究弥补了部分空缺，但之后依然需要更加深入的分析。

通过高通量测序和组装轮叶蒲桃叶绿体样本，获得了轮叶蒲桃完整的叶绿体基因组。该叶绿体基因组的长度为158 591 bp，具有典型的环状结构，含有129个功能基因。叶绿体基因组含有丰富的SSR位点（A/T作为主要成分），并且以A/U结尾的密码子在轮叶蒲桃叶绿体基因组中更容易被使用。通过叶绿体基因组比较分析可以发现，轮叶蒲桃叶绿体基因组的IR边界保守，与蒲桃属其他物种间有较高的相似性，核苷酸水平高。系统发育树支持率比较高，物种间亲缘关系较近。轮叶蒲桃叶绿体基因组特征和系统发育研究对于了解蒲桃属的不同物种非常重要，有助于开发该属的植物资源，并为进一步研究提供理论基础。

参考文献