牛尾菜（Smilax riparia）为百合科（Liliaceae Juss.）植物牛尾菜的根茎（唐进等，1978），俗称龙须菜，是常用民间草药（赵琦，2017）；在中国大部分地区都有分布，是常用壮药，是广西特色中成药中华跌打丸主要成分之一（国家药典委员会，2015），有通络止痛、活血化瘀之功效，用于风湿性关节炎、跌打损伤、腰肌劳损等（Sun et al.，2012）。牛尾菜中具有黄酮类、苷类、酚类以及其他化学物质，具有镇痛、祛痰、抗氧化等药理作用（陈人萍等，2014；Sun et al.，2012）。牛尾菜作为《中国药典》收载的中成药中华跌打丸的“倒挂”药材，其质量标准并未被《中国药典》2020年版收载。虽然《广西壮族自治区瑶药材质量标准》收载了牛尾菜的质量标准，但是其标准仍然局限于外观鉴别和理化鉴定，并未对其进行特征指纹图谱表征和活性成分的含量测定，因此，有必要利用其中的药效确切活性成分建立质量控制方法，进行其关联药效活性的物质筛选是研究的首要问题。

中药通过多种成分的协同作用来发挥疗效，而利用中药谱效关系研究能够筛选活性成分。谱效关系结合指纹图谱的基础及药效学研究的内容，通过指纹图谱和药效之间的关系，筛选出具有中药药效的活性成分（李戎等，2002）。该方法简单且高效，体现了药材提取物中主要成分与药理作用之间的关系大小，为中药主要药效物质的研究提供依据。目前研究发现，抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，从而引起多种疾病。相关研究发现，牛尾菜中的多酚类等成分具有抗氧化活性（陈雯等，2012；Li et al.，2006）。本研究以牛[HJ2mm]尾菜的广西、广东和辽宁等不同产区为主要研究区域，依托广西中药药材资源的道地产区的优势，采用HPLC指纹图谱和清除ABTS自由基的作用的抗氧化测定方法，通过对不同批次的牛尾菜的指纹图谱进行相似度评价、色谱峰面积聚类分析、抗氧化活性测定、偏最小二乘回归分析法，拟探讨以下问题：（1）不同产地的牛尾菜的化学表征有何异同；（2）牛尾菜药材的道地产区在哪里；（3）牛尾菜抗氧化活性的药效物质是什么。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

Waters 2489高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Multiskan Go全波长酶标仪（美国Thermo公司）。

过硫酸钾、甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯；ABTS（2，2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐，2021年购自美国麦克林生化科技股份有限公司）；齐墩果酸（成都普菲德生物科技有限公司，批号：18051406）、熊果酸（成都普菲德生物科技有限公司，批号：18081601）。

牛尾菜药材（编号：S1~S13）经广西中医药大学唐红珍教授鉴定为百合科菝葜属（Smilax L.）植物牛尾菜的根茎（谭小青等，2021a）。药材样品来源信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

取牛尾菜药材粗粉1 g，放入具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液20 mL，超声30 min，放冷，补足减少的质量，使用0.22 μm 有机滤膜滤过，即得。称取适量齐墩果酸、熊果酸，加80%甲醇制成单一对照品储备液，分别精密吸取齐墩果酸储备液0~5 mL与熊果酸储备液0~5 mL，加入80%甲醇稀释，将其定容至5 mL容量瓶，使用0.22 μm 有机滤膜滤过，即为混合对照品溶液（ 齐墩果酸0.038 g·L^-1，熊果酸 0. 047 g·L^-1）。

1.2.2 HPLC色谱条件

WatersCORTECS^® C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流速为0.5 mL·min^-1，柱温20℃，流动相选择0.5%磷酸水（A）-乙腈（B）水溶液，梯度洗脱（ 0~5 min，95% A；5~40 min，95%~5% A；40~45 min，5%~5%A），检测波长205 nm，进样量 2 μL。

1.2.3 方法学考察

精密度试验：取“1.2.1”项下的供试品适量，按“1.2.2”的色谱条件，进样测定6次，计算相对保留时间、相对峰面积的RSD值，实验表明，各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于2.3%，表明仪器精密度良好。重复性试验：取牛尾菜S4的样品适量，共6份，按“1.2.1”制备样品溶液进样测定，计算相对保留时间、相对峰面积的RSD值，实验表明，各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于2.73%，表明方法重复性良好。稳定性试验：取牛尾菜药材的供试品溶液（S4），分别放置0、2、4、8、12、24 h后，按“1.2.2” 的色谱条件进样分析，计算相对保留时间、相对峰面积的RSD值，实验表明，各色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于1.31%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

1.2.4 指纹图谱测定

将制备好的样品溶液和对照品混合溶液，按“1.2.2”HPLC色谱条件测定，记录结果，将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，采用平均数法，设置时间窗宽为0.1，经过多点矫正后，进行全峰匹配，生成对照图谱，确定13批牛尾菜样品指纹图谱的主要共有峰，并进行相似度评价。

1.2.5 牛尾菜指纹图谱聚类分析

将13批牛尾菜样品共有峰的峰面积导入 SPSS 22.0软件，使用 Ward方法和平均欧方距离进行聚类。

1.2.6 抗氧化作用考察

精密称取牛尾菜粉末0.2 g于锥形瓶内，加入80%甲醇溶液100 mL，超声30 min，放冷，补足减少重量，经0.22 um有机滤膜滤过，蒸干，用50%乙醇溶解，将其配成质量浓度为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg·mL^-1的样品溶液。称取 ABTS 38.41 mg，加水溶解后，转移并定容至 10 mL 量瓶中，将其配制成浓度为 7 mmol·L^-1 的溶液，加入浓度为2.45 mmol·L^-1 的过硫酸钾溶液，混合均匀后，放置暗处12~24 h，即得 ABTS+自由基溶液。在96 孔板中，分别加入2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg·mL^-1的样品溶液20 μL，分别加入ABTS+工作液180 μL，以无水乙醇为空白对照，在室温下放置约6 min，在734 nm 波长下测定吸光度，重复3 次（谭小青等，2021b）。ABTS清除率按公式计算= [1-（A_i-A_j）/A₀]×100%，A₀ 空白溶液，即无水乙醇加ABTS的A值；A_i为样品溶液和ABTS反应后的A值；A_j为空白对照的A值。应用清除ABTS自由基的抗氧化测定方法对13个不同批次来源的牛尾菜样品进行了测定，并计算了各样品的IC₅₀值。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱的建立

利用HPLC构建了13个不同产地来源的牛尾菜药材的14个主要共有峰的指纹图谱，牛尾菜样品HPLC叠加图谱见图1，样品对照图谱见图2，另外，通过与对照品比对，指认了其中2个色谱峰，其中9号为齐墩果酸，10号为熊果酸，混合对照品的HPLC图见图3。牛尾菜 HPLC 指纹图谱14个共有峰的峰面积结果见表2。由表2可知， 1号峰和2号峰的峰面积最大， 7号峰的峰面积较大，3、5、14号峰的峰面积较小，其他色谱峰的峰面积大小居中。因此，对指纹图谱的相似度评价影响较大的是1、2、7号峰，而6、9、10、11、12、13号峰对指纹图谱的相似度计算结果的影响相对较小。

在牛尾菜经 HPLC 检测得到的色谱图中，13批药材的相似度在0.965~1.000之间，表明各批次牛尾菜药材质量基本稳定，结果见表3。由表3可知，不同批次S1、S2、S3、 S6、S7、S10和S12的牛尾菜样品的相似度在0.963~1.000之间；而其他批次S4、S5、S8、S9、S11和S13的牛尾菜样品的相似度在0.943~0.960之间。指纹图谱相似度之间的差别虽然能够一定程度上反映出不同产量来源样品之间化学表征的接近程度，但还是不能清晰直观地反映出牛尾菜样品之间的差异，因此，还需要通过对色谱峰的峰面积进行聚类分析来验证。

2.2 牛尾菜指纹图谱聚类分析结果

13批牛尾菜样品14个共有峰的峰面积的聚类结果见图4，横坐标的数字代表距离，纵坐标分别代表13批的牛尾菜样品。由图4可知，13批牛尾菜样品可分为2类，第 I 类包括 S1（辽宁锦州）、S2（广西百色）、S3（福建三明）、S5（贵州贵阳）、S6（广西桂林）、S10（广西南宁）、S12（广西宜州）；第Ⅱ类包括S4（广东清远）、S7（广西贺州）、S8（江西赣州）、S9（广东韶关）、S11（广西金秀）、S13（广西玉林）。其中，第 I 类中S2（广西百色）、S6（广西桂林）、S12（广西宜州）与S5（贵州贵阳）地理位置比较接近，属于贵州省或贵州与广西交接的桂东北地区，而S4（广东清远）、S9（广东韶关）、S8（江西赣州）、S7（广西贺州）、S11（广西金秀）、S13（广西玉林）都是属于广东省或者与广东省交界的地区。因此，通过对指纹图谱共有峰的峰面积的聚类分析可以将地理位置较为接近的牛尾菜药材批次分开来。此外，通过将相似度计算的结果与聚类分析的结果进行比较，二者具有一定的相似性，但是聚类分析能够更清晰直观地反映出牛尾菜样品之间化学表征的差异。

2.3 抗氧化作用考察结果

13个牛尾菜样品的清除ABTS自由基的作用抑制率，以及各样品IC₅₀值的结果见表4。由表4可知，浓度为0.125~2.0 g·L^-1的牛尾菜样品均有一定的抗氧化作用，浓度为2.0 g·L^-1的牛尾菜样品的抗氧化作用清除率大于50%，其余浓度的清除率低于50%。根据各批次样品IC₅₀曲线推测得到其IC₅₀值均在1.05~1.94之间且相差将近一倍，样品的IC₅₀值越小说明样品的抗氧化活性越好。因此，S3（福建三明）的抗氧化活性最好，其次是S2（广西百色）、S13（广西玉林）、S12（广西宜州）；而S10（广西南宁）、S11（广西金秀）的抗氧化活性相对较弱，S1（辽宁锦州）和S7（广西贺州）的更弱；其余批次的活性居中。按抗氧化作用强弱的结果进行分类，得到的结果与指纹图谱相似度结果及聚类分析结果不完全一致，说明指纹图谱仍然不能区分药材的药效活性强弱。

2.4 谱效关系分析

以指纹图谱中共有峰面积为自变量，13批牛尾菜的抗氧化活性抑制率为因变量，进行偏最小二乘回归分析，得到二者的谱效关系系数值及其VIP值（刘振杰等，2020）。13批牛尾菜的指纹图谱峰面积与其抗氧化活性的谱效关系分析见图5，其VIP值见图6。由图5和图6可知，指纹图谱中的1、2、3、5、6、9、14号峰面积与抗氧化效果均呈正相关，4、7、8、10、11、12号峰与抗氧化效果均呈负相关；9、11、3、4、5号峰的VIP值均大于1，说明这些峰在抗氧化作用中效果比较显著，进一步提示齐墩果酸可能是牛尾菜有抗氧化作用的化学成分。

2.5 齐墩果酸体外抗氧化验证试验

精密称定活性化合物单体（齐墩果酸）对照品，无水乙醇溶解后，转移至10 mL容量瓶，定容；取以上溶液，无水乙醇稀释，将其配制成为1.0、0.5、0.25、0.125、0.065 mg·mL^-1的质量浓度的溶液。按“1.2.6”项下方法操作，计算齐墩果酸的清除率。实验结果表明，齐墩果酸对ABTS自由基的清除率分别为26%、47%、70%、71%、81%，其IC₅₀值为0.194，说明齐墩果酸有较强的清除ABTS自由基的能力，是牛尾菜抗氧化活性的主要成分之一。

3 讨论与结论

本研究采用HPLC法，首次建立了不同产地的13批牛尾菜的指纹图谱，确定14个主要共有色谱峰，指认了齐墩果酸和熊果酸2个色谱峰，13批药材具有较高相似度说明牛尾菜药材质量基本稳定。另外，由于中药指纹图谱具有模糊性和整体性的特点（张慧等，2018），其与含量测定的要求不同，对色谱峰的分离度无高要求，不要求所有色谱峰完全分开，而本文中牛尾菜指纹图谱的14个主要色谱峰的分离度介于0.79~7.02之间，除个别色谱峰分离度低于1.0外，其余色谱峰分离度基本大于1.0，齐墩果酸和熊果酸的参照峰的分离度也达到1.0以上，虽然指纹图谱不需要将所有峰分开，但是后期对目标成分进行含量测定的时候，仍然需要对目标色谱峰的条件方法进行优化，使分离度达到1.5及以上。

牛尾菜的聚类分析结果表明地理位置比较接近的牛尾菜样品聚为一类，并且地域相近的牛尾菜的化学指纹图谱相似度高，这说明地理条件、气候因素等可能是影响牛尾菜化学表征差异形成的关键因素，而这也是中药道地药材形成的原因之一（徐浩等，2021）。广西牛尾菜是广西特色中成药品种《中华跌打丸》的一味主要药材（钟海森等，2018），因此广西牛尾菜可能具有一定的道地性。本实验结果也在一定程度上印证了这一点，福建三明的牛尾菜的抗氧化活性最好，其次是广西百色、广西玉林、广西宜州。

基于清除ABTS自由基的抗氧化测定方法的牛尾菜样品测定表明，不同产地批次的牛尾菜的抗氧化活性存在较大的差别，说明牛尾菜药材中可能存在关键的抗氧化活性物质，牛尾菜中含有大量的鞣质类成分（赵琦，2017），这些成分常常作为工业生产原料使用，而牛尾菜中的皂苷类成分可能是其发挥药效的主要成分，有相关研究结果报道了皂苷类成分良好的药理活性（查正霞等，2020），如白头翁药材中的白头翁皂苷B4目前已经开发出国家兽药新药并投产，人药剂型也在研发中，而齐墩果酸作为三萜皂苷类化合物；黄勤英等（2019）研究表明其有抗氧化作用，本文体外抗氧化验证试验结果也说明齐墩果酸具有较强的抗氧化能力，与黄勤英等的研究结果相吻合。此外，本文通过谱效关系研究发现牛尾菜的指纹图谱中1、2、3、5、6、9、14号峰都与其抗氧化能力呈正相关，表明牛尾菜的抗氧化作用可能是多种成分共同作用的结果。目前，虽然有较多相关研究对牛尾菜根茎的化合物进行了分离鉴定（龚韦凡等，2017），但是这些研究可能没有针对性的分离出活性成分和指标性成分，因而造成在质量控制标准中活性成分鉴定的困难，所以，将指纹图谱中的其他高活性的化合成分进行针对性的分离，并鉴定这些成分，进一步探究其药理活性，将是本课题今后的研究方向。

参考文献