摘要
为解析C3H基因在太白贝母种子萌发过程中的作用，基于低温萌发转录组数据，该研究通过生物信息学的方法对太白贝母C3H基因家族进行系统鉴定及表达分析，筛选出5个低温高表达候选基因并解析其对赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的响应机制。结果表明：（1）C3H家族65个成员中7个为稳定亲水蛋白、58个不稳定亲水蛋白，蛋白长度差异显著（197~1 451 aa），仅FtC3H43和1C3H50定位于叶绿体/内质网，其余位于细胞核。（2）保守基序分析发现，Motif1和Motif3普遍存在C3H蛋白中；系统进化分析结果显示，196条C3H蛋白被聚类为5个不同的分支，分别标记为I-Ⅴ，太白贝母C3H成员与拟南芥和水稻表现出较近的亲缘关系。（3）GA3处理下，FtC3H22和FtC3H35在A-C时期促进萌发，FtC3H40在A期、FtC3H46在E期响应调控；ABA处理时FtC3H46显著上调，而FtC3H22和FtC3H35下调，推测FtC3H46参与ABA介导的抗寒途径，FtC3H22和FtC3H35则正向调控萌发。该研究揭示了C3H蛋白家族在太白贝母种子萌发过程中的重要作用和复杂调控机制。
Abstract
To analyze the role of C3H genes during the germination of Fritillaria taipaiensis seeds, this study utilized low-temperature germination transcriptome data and bioinformatics methods to systematically identify and analyze the expression of the C3H gene family in F. taipaiensis. Five low-temperature candidate genes with high expression were identified and their response mechanisms in response to gibberellic acid (GA3) and abscisic acid (ABA) were elucidated. The results were as follows:（1）Among 65 identified C3H family members, 7 were classified as stable hydrophilic proteins and 58 exhibited instability, with significant variation in protein length (197-1 451 aa). Only FtC3H43 and FtC3H50 were localized to chloroplast/endoplasmic reticulum, while the others were nuclear-localized. （2）Conserved motif analysis revealed that Motif1 and Motif3 were widely present in C3H proteins. Phylogenetic analysis results showed that 196 C3H proteins were clustered into five distinct clades (I-V), with F. taipaiensis C3Hs showing close evolutionary relationships to those in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa. （3）Under GA3 treatment, FtC3H22 and FtC3H35 promoted germination during early-to-mid stages (A-C), while FtC3H40 and FtC3H46 exhibited stage-specific expression at stages A and E, respectively. ABA treatment significantly upregulated FtC3H46 but downregulated FtC3H22 and FtC3H35, suggesting FtC3H46 might mediate ABA-dependent cold stress responses, whereas FtC3H22 and FtC3H35 played positive roles in germination regulation. This study reveals the important role and complex regulatory mechanism of the C3H protein family in the seed germination of F. taipaiensis.
Keywords
川贝母是我国珍稀名贵中药材，具有润肺止咳、化痰平喘、散结消肿等功效（刘梓贤等，2022）。太白贝母（Fritillaria taipaiensis）为川贝母药材的重要基原植物，是百合科贝母属多年生草本药用植物。该物种主要分布在云南、重庆、四川、甘肃等海拔3 000 m以上的高山区域（中国科学院中国植物志编辑委员会，1997）。值得注意的是，自2021年贝母属植物被列入国家二级保护植物后（国家林业和草原局农业农村部，2021），野生资源的采挖受到严格限制，导致原料市场供给缺口持续扩大，使得人工栽培的川贝母逐渐成为药材市场的主要来源（郭尚磊，2020）。太白贝母的繁殖生物学特性较为特殊：其种子繁殖过程中存在生育期（约100 d）与休眠期（可达200 d以上）的显著时序差异。这种生物学特性导致实际栽培中有效生育期缩短，成为制约产量提升的关键因素（李庆等，2021）。因此，突破种子休眠机制、促进萌发进程，对于延长植株生长期、提高鳞茎生物量积累具有重要实践价值，这也是当前太白贝母人工栽培研究的重点方向。
蒋明等（2016）研究表明，C3H蛋白家族在植物生长发育与逆境响应中具有多维度调控功能。对模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究揭示了该家族成员的特异性作用机制：AtC3H14通过介导次生细胞壁生物合成途径调控植株形态建成（Ko et al.，2009），而AtC3H15则表现出双重调控特性——既能正向增强灰霉病抗性，又可负向抑制系统获得性抗性（Wang et al.，2020）。值得关注的是，C3H蛋白对木质素代谢通路的调控效应在木本植物中尤为显著。Li等（2022）研究表明，大青杨（Populus ussuriensis）PuC3H35通过激活PuEARLI1基因表达，特异性促进根系木质素合成与维管组织分化，这种分子级联反应不仅加速根系发育进程，还显著提升植株整体抗逆能力。
低温胁迫作为植物生长发育的重要限制因子，其分子应答机制研究备受关注。在楸树（Catalpa bungei）低温响应信号转导网络解析中，Bao 等（2024）研究发现C3H基因家族成员CbuC3H24和CbuC3H58呈现显著的低温诱导表达特征，它们被证实为调控楸树耐寒性的关键效应因子。值得注意的是，植物激素网络在低温响应中具有枢纽作用：赤霉素（GA3）作为破除种子休眠的核心信号分子，与脱落酸（ABA）构成的拮抗调控模块，共同决定种子萌发进程与抗逆响应平衡。前人研究虽已明确C3H蛋白在植物发育调控中的普适性功能，但针对其在药用植物低温萌发阶段的特异性作用机制——特别是对 GA3、ABA 信号通路的调控方式及其在太白贝母种子低温发芽中的生物学功能，仍属尚未探明的科学盲区。
课题组前期研究发现，低温胁迫处理可显著提升太白贝母种子的萌发速率与萌发同步性，揭示其种子萌发过程具有独特的低温响应特性。基于 C3H 锌指蛋白在植物低温信号转导与发育调控中的核心作用（蒋明等，2016），本研究为深入研究太白贝母 C3H 家族成员在太白贝母种子低温萌发过程中的生物学功能，通过整合生物信息学预测与分子生物学验证技术，系统开展以下研究：（1）鉴定 FtC3H 家族成员并系统解析其理化特性与亚细胞定位特征；（2）构建包含系统进化关系、保守结构域分布及组织特异性表达模式分析；（3）基于低温萌发过程的激素动态变化，筛选与 GA3和 ABA 信号通路协同响应的关键 FtC3H 成员。
1 材料与方法
1.1 材料
野生抚育的太白贝母种子来源于重庆市巫溪县兰英乡西安村，经重庆市中药研究院彭锐研究员鉴定为太白贝母。
1.2 方法
1.2.1 转录组测序及组装与低温（4 ℃）层积与常温（25 ℃）层积处理构建太白贝母种子萌发对照体系
材料获取与处理流程如下：（1）初代种子。2020年6月采收成熟蒴果，筛选饱满种子液氮速冻后-80 ℃保存（A组）。（2）层积处理。剩余种子湿沙层积（湿度30%~40%），经30 d室温适应后转入4 ℃处理，动态监测胚发育进程。（3）分期取样。分别于胚率约12%（A）、25%（B）、50%（C）、100%（D）及种胚突破种皮 1~3 mm（E）采集低温处理样本，同步获取对应时间点常温层积对照样本（a、b、c、d、e）。（4）萌发诱导。胚成熟后转至15 ℃ 促发胚根生长，选取种胚突破种皮1~3 mm 种子作为终末样本。最终建立包含5个发育阶段（A-E）及5个对照时间点（a-e）进行转录组测序。
1.2.2 试验材料处理
本试验样品采集于2023年7月，在4 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下进行培养。基于转录组数据，如图1所示，选取5个不同生长阶段的种子各50粒，用2种不同的植物激素处理（100 mg·L-1的ABA和100 mg·L-1的GA3处理），以清水作为对照。处理后，在0 h和0.5 h时立即将种子表面的水分擦干，放入液氮中快速冷冻，转移至-80 ℃中存储，供后续实验使用。
图
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太白贝母种胚发育的5个时期
Fig.
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Five stages of seed embryo development in Fritillaria taipaiensis
1.2.3 太白贝母 C3H 基因家族鉴定
原始数据经过过滤、测序错误率、GC 含量的分布检查，获得用于后续分析使用的Clean reads。将Trinity拼接得到的转录本序列（86 662条），经 Rapclust 层次聚类优化，获得非冗余Unigenes集，通过 KEGG、NR、Swiss-Prot、KOG、Trembl 数据库联合注释，成功注释到 61 574 条 Unigenes。基于太白贝母种子萌发的转录组测序数据，利用 NR、NT、Swiss-Prot 和 PFAM 数据库，对太白贝母C3H基因进行筛选注释，并将注释得到的转录因子相关基因编码的蛋白进行 NCBI BLAST和SMART预测。
1.2.4 太白贝母 C3H 基因家族亚细胞定位及理化性质分析
对太白贝母种子C3H基因家族成员的氨基酸数、等电点（pI）、不稳定指数、相对分子质量、带正负电残基总数等在Expasy在线网站（http://web.expasy.org/protparam/）进行预测；同时深入挖掘太白贝母种子C3H基因家族成员的亚细胞定位信息，将收集的太白贝母种子 C3H 基因家族成员的序列数据，利用CELLO在线分析工具（http://cello.life.nctu.edu.tw/）获取 C3H 成员在细胞内定位的精确信息。
1.2.5 太白贝母C3H 基因家族系统进化树构建
基于PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）下载的水稻和拟南芥 C3H 氨基酸序列，通过 MEGA 7.0 软件（Kumar et al.，2016）对太白贝母、水稻和拟南芥的 C3H 基因家族氨基酸序列进行多序列比对，采用 MEGA 的邻接（neighbor-joining, NJ）法构建系统进化树，其中 Bootstrap 为1 000。通过 iTOL 在线网站（https://itol.embl.de/）进行美化。
1.2.6 太白贝母 C3H 基因家族系统发育树、保守结构域和保守基序分析
利用 MEGA 7.0软件对太白贝母 C3H 基因家族氨基酸序列进行多序列比对，并构建系统发育树，利用 NCBI 的 CD-Search在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进行保守结构域分析，利用MEME 在线网站进行保守氨基酸基序分析，利用TBtools（Chen et al.，2020）进行可视化，并完成进化树、保守结构域和保守氨基酸基序的综合绘图。
1.2.7 太白贝母候选C3H基因在 GA3 和 ABA 处理下的表达模式分析
在转录组数据分析与注释的基础上，利用转录组数据挑选出太白贝母低温种子萌发过程中5个阶段表达水平最高的5个C3H基因，利用 NCBI 的 Primer-BLAST 设计特异性引物（表1），进行实时荧光定量PCR实验，并将得到的相对表达量数据进行整理，使用 GraphPad Prism 8.3.0 软件中的t检验方法比较检验处理间差异显著性并绘制图表。
（1）实时荧光定量PCR反应体系构建：使用反转录 cDNA 和相关引物进行体系构建（表2），配置过程在冰中进行。
表
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实时荧光定量PCR引物
Table
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Primers for quantitative real-time PCR
表
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实时荧光定量PCR反应体系
Table
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Quantitative real-time PCR reaction system
（2）实时荧光定量PCR反应程序：对配置好的体系进行上机操作（表3），最终通过 2-ΔΔCt法进行表达量计算。每次试验均进行 3 次生物学重复，将均一化处理后的数据，使用 GraphPad Prism 8.3.0 软件中的t检验方法比较检验处理间差异显著性并绘制图表。
表
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实时荧光定量PCR反应程序
Table
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Quantitative real-time PCR reaction procedures
2 结果与分析
2.1 太白贝母C3H基因家族鉴定及理化性质分析
将前期课题组的太白贝母转录组数据注释得到的61 574条蛋白序列提交至 PlantTFDB数据库中进行BLAST分析，通过 CDD 和 pfam 对得到的序列进行筛选验证，共筛选得到65条具有 C3H 结构域的序列，将其分别命名为 FtC3H1-FtC3H65。65条 C3H转录因子的氨基酸数在197~1 451之间，其中 FtC3H14 氨基酸数最多（1 451），FtC3H25 氨基酸数最少（197）；等电点为4.59~9.70。脂肪性系数为34.87~78.44，不稳定指数为29.32~77.38（表4）。GRAVY 值为-1.588~-0.223，65条太白贝母种子 C3H 的氨基酸序列中有45条亲疏水值是负值且小于-0.5，占69.23%，可以推出大部分太白贝母种子 C3H 蛋白是亲水蛋白，两性蛋白占30.77%，并且没有明显的疏水区域，因此可认为这些蛋白都是亲水蛋白。综合上述理化性质分析，太白贝母种子 C3H 蛋白中有7个 C3H 蛋白属于稳定亲水蛋白，58个 C3H 蛋白属于不稳定亲水蛋白，亚细胞定位预测显示，除FtC3H43 和 FtC3H50 定位在叶绿体和内质网以外，其余 C3H 蛋白均位于细胞核中，该预测结果可为后续研究太白种子 C3H 转录因子家族的功能提供了重要的线索和基础。
表
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太白贝母候选基因理化性质及亚细胞定位
Table
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Physical and chemical properties and subcellular localizations of candidate genes of Fritillaria taipaiensis
2.2 太白贝母种子C3H基因家族进化分析
系统进化分析结果表明，196条 C3H 蛋白被聚类为5个不同分支，分别标记为I-Ⅴ。在5个分支中均同时包含了太白贝母、拟南芥和水稻的 C3H 家族成员，各家族成员在第5个分支中的数量最多。太白贝母 C3H 成员与拟南芥和水稻表现出较近的亲缘关系，如FtC3H40蛋白与拟南芥的AT1G75340.1亲缘关系较近，FtC3H23蛋白与水稻的ONIVA12G01340.1 较近，说明二者可能与拟南芥和水稻的这两条蛋白具有相似的功能和特点。太白贝母、拟南芥和水稻各自的 C3H 家族成员在各分支中分布不均匀，可能是由于3个物种在进化过程中经历不同的基因组进化事件或者在进化过程中朝多个方向发展（图2）。
图
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太白贝母、拟南芥和水稻 C3H 基因家族蛋白系统进化树
Fig.
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Phylogenetic tree of C3H gene family proteins in Fritillaria taipaiensis, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
2.3 太白贝母C3H基因家族保守基序和保守结构域分析
保守基序分析结果显示，FtC3H 蛋白中包含10个保守基序（图3：A），其中 FtC3H10、FtC3H11、FtC3H12、FtC3H13、FtC3H14、FtC3H20、FtC3H44 均含有Motif 1、Motif 3、Motif 5、Motif 9、Motif 10，数目最多；同一族的 FtC3H14、FtC3H39、FtC3H41、FtC3H53、FtC3H54、FtC3H57、FtC3H58 均含有Motif 6、Motif 8，其他各亚族内的不同成员也具有相似的基序（motif）组成，除此之外，大部分成员都含有 Motif 1 和 Motif 3，并且 CCCH 基序中4个（3个半胱氨酸和1个组氨酸）氨基酸是完全保守的，说明 C3H 家族在遗传进化上还是相对保守，并且C3H残基之间氨基酸的种类和数量不同，很可能会导致 C3H 成员功能相似或互补。
保守结构域分析发现，除C3H家族的共识序列 zf-CCCH 和 ZnF-C3H1 在 FtC3H 基因家族成员中广泛存在外，还鉴定出 Ank（锚蛋白，Ankyrin）、KH（K-homology）、YTH1（YT521B homology）、RRM（RNA recognition motif）等多个结构域（图3：B）。这表明FtC3H 基因家族可能具有多层次的功能协同作用。
图
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太白贝母C3H家族蛋白保守基序和保守结构域分析
Fig.
3
Conserved motif and domain analysis of C3H family proteins of Fritillaria taipaiensis
2.4 太白贝母种子C3H基因家族表达模式分析
为了挖掘太白贝母种子中响应低温胁迫的 C3H 基因，本研究对低温和常温2种条件下的太白贝母种子中的 C3H基因表达情况进行了分析。转录组分析结果发现，所有的C3H基因均在种子萌发的第一阶段高表达，只有FtC3H22、FtC3H35、FtC3H36、FtC3H40、FtC3H46 在低温条件下的5个阶段中，基因表达量均高于常温的5个阶段（图4）。在种子萌发过程中，FtC3H22、FtC3H35、FtC3H36、FtC3H40和FtC3H46在萌发A时期的表达量达到峰值，表明这些基因可能在该阶段具有显著的正向调控功能。
图
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C3H家族成员在种子不同萌发阶段转录组分析
Fig.
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Transcriptome analysis of C3H family members at different germination stages of seeds
2.5 太白贝母候选C3H基因在GA3处理下的表达分析
GA3是种子萌发过程中最重要的激素，可以打破种子休眠，为研究太白贝母种子的FtC3H22、FtC3H35、FtC3H36、FtC3H40 和 FtC3H46 在低温条件下对 GA3的响应情况，本研究利用激素处理和实时荧光定量的方法，以在低温条件下分别经过 GA3处理后的太白贝母种子作为材料，利用实时荧光定量PCR 检测FtC3H22、FtC3H35、FtC3H36、FtC3H40 和 FtC3H46 的表达量。
GA3处理后（图5），5个候选基因在种子萌发的各个时期都有不同程度的激素响应。其中，FtC3H22、FtC3H35在种子萌发A、B、C时期显著高于对照（较对照上调约3倍），说明 FtC3H22、FtC3H35 在A、B、C时期可能通过响应 GA3信号，正向调控种子早期的萌发进程；FtC3H36 在种子萌发的E时期表达高于其他时期；FtC3H40 在种子萌发A时期表达高于其他时期，说明FtC3H40 在A时期通过响应激素来促进该时期种子的萌发；FtC3H46 在E时期高度表达（与对照相比上调约2.5倍），说明其主要通过响应 GA3来参与调控种子后期萌发。
图
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GA3处理对C3H家族成员表达量的影响
Fig.
5
Effects of GA3 treatment on the expression levels of C3H family members
2.6 太白贝母候选C3H基因在ABA处理下的表达分析
在ABA 处理后（图6），在种子萌发的B、C、E时期，FtC3H22 的表达量显著升高，而在A、D时期，FtC3H22 的表达量则显著降低；种子萌发B、C时期，FtC3H35 的表达量显著增加，而在A时期，FtC3H35 的表达量显著低于对照组；FtC3H36 只在种子萌发的C、D时期显著低于对照组，其他时期无明显变化；FtC3H40 在A、B、D时期表达量显著高于对照，C时期显著低于对照；FtC3H46 在萌发的A、B、C时期表达量显著升高，其他时期无明显变化。
图
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ABA处理对C3H家族成员表达量的影响
Fig.
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Effects of ABA treatment on the expression levels of C3H family members
3 讨论与结论
植物 C3H 锌指蛋白是一种转录因子，可识别并结合mRNA，进而实现对基因表达的调控，在植物生长发育中发挥重要作用（Tian et al.，2023）。本研究从太白贝母中鉴定到 C3H蛋白65个。理化性质分析结果显示，C3H 蛋白的氨基酸数、相对分子质量、等电点、脂肪性系数等均有差异，暗示了不同的 C3H 蛋白发挥生物学功能所需pH环境有所差异，65条太白贝母 C3H 氨基酸序列中有45条亲疏水值是负值且小于-0.5，推测大部分太白贝母种子C3H 蛋白质是亲水蛋白，亚细胞定位预测显示，除 FtC3H43 和 FtC3H50 定位在叶绿体和内质网外，其余 C3H 蛋白均位于细胞核中，该预测结果为后续研究太白种子 C3H 转录因子家族的功能提供了重要的线索和基础。
在太白贝母低温萌发的第1个阶段，即种子打破休眠阶段，65个C3H基因都显著高表达，这可能与 C3H基因促进植物生长发育和响应低温胁迫的调控作用有关，因此它们可能参与了低温胁迫或种子的萌发。在种子萌发的5个阶段中一直保持高表达的FtC3H22、FtC3H35、FtC3H36、FtC3H40 和 FtC3H46 被认为是太白贝母中最关键的5个 C3H 基因。GA3 是打破种子休眠的植物激素，而与GA3互为拮抗的ABA则促进种子休眠，但同时C3H基因提高植物的抗寒性需要依赖于 ABA 介导的激素途径。外源激素处理实验结果发现，5个 FtC3H基因在种子萌发的5个阶段（A-E）呈现动态表达特征，进一步揭示其功能分工与协同机制。在萌发启动阶段（A阶段），喷施 GA3 后FtC3H46 表达量无显著变化，而喷施 ABA后其表达量显著上调；相反，FtC3H22和FtC3H35 仅特异性响应 GA3信号。这与柳枝稷（Panicum virgatum）中 PvC3H72 通过 ABA 途径增强抗寒性的分子机制高度保守（Xie et al.，2019）相似，提示 FtC3H46 可能主导 ABA 依赖的低温胁迫应答，而 FtC3H22和 FtC3H35 则参与 GA3信号驱动的萌发启动。
随着萌发进程推进（B-C阶段），FtC3H22和FtC3H35在 GA3和 ABA 双处理下均出现显著表达峰值，提示其功能从单一萌发调控向“促萌发-抗逆”双重角色转变。值得注意的是，在胚根发育关键阶段（E阶段），FtC3H46 在 GA3处理时表达量较 ABA 处理组提升约3.8倍，其动态模式与美洲黑杨（Populus deltoides）中 PdC3H17 通过根发育增强抗旱性的功能特征相似（Zhuang et al.，2020），提示该基因可能通过调控根系形态建成增强低温适应性。此外，FtC3H40 在全程维持 ABA 响应特征，而 FtC3H22特异性在C、E阶段激活，分别对应持续抗寒调控和萌发终末阶段的特异性功能。
本研究揭示了 C3H 基因家族成员通过时序性表达重编程实现功能可塑性，在种子萌发过程中动态平衡“生长发育-胁迫应答”双重需求。FtC3H46 可能通过阶段特异性功能转换（A阶段抗寒应答，E阶段根发育调控）实现多重生物学效应，该发现为解析植物转录因子的时空功能分化提供了新视角。这些结果为药用植物低温萌发调控网络的解析及抗逆分子育种靶标筛选奠定了重要理论基础。
致谢 感谢徐艳姣、李炎、张晓玉、吴靓、陈永生参与部分实验及数据整理；董家帮承担转录组数据分析与基因筛选工作；梁艳丽老师负责项目构思，并指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。谨向上述各位作者表示由衷的感谢。