摘要
为揭示不同生长年限短萼黄连根组织及根际土壤中的微生物群落的特征和多样性，该研究采用Illumina高通量测序技术对一年生、两年生和多年生短萼黄连的根内及根际土壤进行测序研究。结果表明：（1）根际土壤微生物群落的α多样性指数（Shannon、Ace、Chao 1）及总操作分类单元（OTUs）数量均显著高于相同生长年限的根组织样品。（2）不同年限短萼黄连根内以变形菌门、放线菌门和子囊菌门为优势菌门，慢生根瘤菌属、根瘤菌属菌群、游动放线菌属和Leptodophora为优势菌属；根际土壤则以变形菌门、放线菌门、子囊菌门和被孢菌门为优势菌门，norank_f_Xanthobacteraceae、慢生根瘤菌属、norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、Epicoleosporium和被孢霉属为优势菌属。（3）短萼黄连根内及根际土壤微生物多样性随生长年限变化显著，尤以第一至第二年为关键转变期。（4）LEfSe分析显示，根内及根际土壤中标志菌群随短萼黄连生长呈现动态变化。一年生根内显著富集游动放线菌属、假诺卡氏菌属、Epicoleosporium，其根际土壤则显著富集MND1、鞘脂单胞菌属、Epicoleosporium；多年生根内显著富集慢生根瘤菌属、Steroidobacter、酵母属，其根际土壤则富集慢生根瘤菌属、Candidatus_Xiphinematobacter、木霉属。综上认为，该研究初步阐明了短萼黄连根内及根际微生物群落的结构特征及演替规律，为未来研制促进短萼黄连生长发育及病害防控的微生物制剂提供了重要的理论支撑。
Abstract
To investigate the characteristics and diversity of microbial communities in roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala with different growth years, this study employed Illumina high-throughput sequencing technology to sequence the roots and rhizosphere soils of 1-year-old, 2-year-old, and perennial plants. The results were as follows: (1) The α diversity indices (Shannon, Ace, Chao 1) and the number of total operational taxonomic units (OTUs) in the rhizosphere soils of microbial communities were significantly higher than those in the root tissue samples of the same growth year. (2) Microorganisms in roots were predominantly composed of Proteobacteria, Actinobacteriota, and Ascomycota as the dominant phyla, with Bradyrhizobium, Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium, Actinoplanes, and Leptodophora as predominant genera; in contrast, the rhizospheric soils exhibited Proteobacteria, Actinobacteriota, Ascomycota, and Mortierellomycota as the dominant phyla, while norank_f_Xanthobacteraceae, Bradyrhizobium, norank_f_norank_o_Vicinamibacterales, Epicoleosporium, and Mortierella were identified as the dominant genera. (3) The microbial diversity in both roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala exhibited significant changes with growth years, especially during the critical transition from the first to the second year. (4) LEfSe analysis demonstrated dynamic shifts in signature microbial communities in roots and rhizosphere soils across the growth stages of Coptis chinensis var. brevisepala. 1-year-old roots were significantly enriched with Actinoplanes, Pseudonocardia and Epicoleosporium, while their rhizosphere soils were notably enriched with MND1, Sphingomonas and Epicoleosporium; in contrast, Bradyrhizobium, Steroidobacter and Saccharomycopsis were significantly enriched in perennial roots, and Bradyrhizobium, Candidatus_Xiphinematobacter and Trichoderma were preferentially enriched in perennial rhizosphere soils. Through this project, the structural characteristics and succession patterns of microbial communities in roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala are preliminarily elucidated, providing a theoretical foundation for developing microbial agents to enhance growth and disease resistance.
短萼黄连（Coptis chinensis var. brevisepala）属多年生草本植物，体内富含小檗碱，具有清热燥湿、泻火解毒等功效（茆菁华和刘学医，2012）。然而，长期受人为过度采挖以及生境破坏影响，其种群数量锐减，自然资源也渐趋枯竭。目前，在安徽宣城、江苏宜漂山区、浙西部分山区等原产地，短萼黄连已难觅踪迹，仅在自然保护区有零星分布（刘学医，2008）。鉴于其濒危现状，自2013年起，短萼黄连被列为中国国家二级重点保护野生植物。当前，短萼黄连只作为“宣黄连”收载于《安徽省中药饮片炮制规范》中，而并未收入《中国药典》（张莉和张小平，2005；陈萍萍和刘学医，2012）。
植物内生菌是指在植物生长的某一时期或整个生命周期内，存在于植物体内且未导致宿主植物出现明显病害的一类微生物群体（王志伟等，2015）。内生菌与植物形成了互惠共生关系，对植物的生长、次生代谢产物积累和抗逆性提升具有重要影响。杜佳慧等（2022）研究发现，多花黄精内生菌可显著提高种子发芽势和发芽率，促进幼苗生长。此外，从石榴叶内生真菌Phoomopsis liquidambari代谢产物中分离得到的4-羟基肉桂酸，能有效猝灭病原菌群体感应，抑制病原菌生长（Zhou et al.，2022）。根际作为植物与土壤相互作用的关键区域，存在特定的微生物种群，这些微生物与植物根系相互作用，并受根系分泌物调节（程龙媛等，2024）。根际微生物在植物适应性调节、养分吸收和免疫激活等方面发挥重要作用（刘京伟等，2021；华喆等，2024）。植物根际促生细菌在根际微生物中具有绝对的数量优势，能在不同胁迫条件下促进植物生长。摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae）和根内球囊霉（Glomus intraradices）可通过增强青冈栎的抗氧化酶活性，提升其耐旱能力（李娇娇和曾明，2020）。程龙媛等（2024）研究表明，内生菌和根际微生物协同调控药用植物的生长与品质。在干旱环境下，对黄芪、甘草、枸杞施用深色有隔内生菌，可增加根际微生物丰度，助力药用植物旱地种植（He et al., 2019, 2022a, b）。因此，研究植物、内生菌及根际微生物间的互作，对药用植物种植及其可持续发展具有重要指导意义。
连作障碍是药用植物种植中常见的问题，土壤微生物群落结构失衡被认为是连作障碍形成的重要原因。随着种植年限的增加，枳壳（吴微微等，2024）、党参（孟彤彤等，2023）等药用植物根际微生物群落结构发生显著变化，有益细菌和真菌丰度下降，潜在致病菌属丰度上升，这可能与植物根系分泌的特异性物质相关。刘云露（2019）发现，酚酸降解菌在黄连种植年份较高的根际土壤中富集，推测这与黄连根系持续向土壤中释放酚酸有关。因此，研究不同种植年限药用植物的根际微生物特征，对解决连作障碍问题至关重要。
短萼黄连作为濒危植物，与常见植物相比，其微生物群落可能具有独特的组成和功能，这可能与其生存策略、环境适应性及濒危机制密切相关。然而，目前对短萼黄连的研究主要集中在资源调查、种群保护和濒危机制探讨等，有关其微生物菌群的研究还未见国内外文献报道。本研究以浙江省清凉峰自然保护区为研究区域，采用高通量测序方法，通过对一年生、两年生和多年生短萼黄连根组织和根际土壤的微生物群落结构与多样性进行系统分析，拟探讨以下问题：（1）短萼黄连根部内生菌群落和根际土壤菌群结构特征及二者的联系如何；（2）短萼黄连根内及根际微生物群落随生长年限的变化规律，以及各生长阶段的优势微生物类群（有益和有害菌株）。本研究结果有望为短萼黄连的后续人工繁育和保护利用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2024年1月上旬，在浙江清凉峰国家级自然保护区的短萼黄连群落中采集健康植株样品。采集样品时，随机选取1 m × 1 m大小的样方，在每个样方中选取1株健康短萼黄连植株。短萼黄连经浙江省中医药研究院浦锦宝研究员鉴定。鉴于短萼黄连野外种群数量少、多为极小种群的濒危现状，为尽量减少对物种及其原生境的干扰，本研究选择龙塘山分布点（118°54′04″E、30°06′37″N，海拔910.93 m）的短萼黄连群落作为采样区。该区种群个体数量适中且能够较好地代表短萼黄连的自然生境。短萼黄连是多年生植物，常规按照叶片数目判断生长年限（一年生：1~2片真叶；两年生：3~5片真叶；多年生：10片真叶及以上）（张莉和张小平，2005）。一年生、两年生和多年生短萼黄连各5株，共计15株，用无菌刷去除大块土壤，保留1 mm左右的土壤附着在根上，将植物根部放入无菌管中，加入50 mL PBS缓冲液，用无菌镊子用力搅拌，以便从根表面分离根际土，移除根后，低温高速离心，沉淀即为根际土样本。根组织采用75%的酒精消毒 5 min，无菌水冲洗，0.1%的次氯酸钠消毒 10 min，最后用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分，将处理后的根际土壤和根组织样本装入无菌管中，存于-80 ℃。一年生、两年生和多年生短萼黄连根分别编号Root1、Root2和Root3，根际土壤分别编号为RS1、RS2和RS3，每个处理5份样本。
1.2 基因组DNA提取及PCR扩增
根据 E.Z.N.A.® soil DNA kit（Omega Bio-Tek, Norcross, GA, U.S.）操作手册，提取微生物群落的总基因组DNA。经DNA质量评估，以及DNA纯度和浓度测定后，合格的DNA作为模板用于PCR扩增，具体使用以下引物：对根组织样本的16S V5-V7可变区域采用799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）；对土壤样本中16S V4可变区使用515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；对所有样本中的ITS区域使用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。PCR反应体系：5×Pro Taq 10 μL，上游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，模板DNA 10 ng·μL-1，用水补足至20 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性3 min，接着进行27个循环（95 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.3 文库构建与测序
使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit构建PCR产物的文库。过程包括：（1）接头连接；（2）通过磁珠筛选去除接头自连的片段；（3）利用PCR扩增富集文库模板；（4）使用磁珠回收PCR产物，获得最终文库。利用上海美吉生物医药科技有限公司Illumina PE300/PE250平台进行测序。
1.4 高通量测序数据质控与统计分析
先使用Fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.19.6）对双端原始测序数据进行质量筛查，再使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.11）进行拼接。拼接后，应用UPARSE 11（http://drive5.com/uparse/）对数据进行可操作分类单位（operational taxonomic units，OTUs）聚类，聚类阈值设定为97%相似度，并去除嵌合体序列。剔除叶绿体和线粒体序列后，抽平各样本，确保99.09%以上的序列覆盖度（Good’s coverage）。使用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.11）结合Silva 16S rRNA数据库（v138）和UNITE真菌ITS数据库（v8.0）进行物种注释，置信度为70%，并统计群落结构。
所有数据分析在美吉生物云平台（https://cloud.majorbio.com）上进行，具体流程如下：使用mothur软件计算α多样性指数，并结合Kruskal-Wallis秩和检验分析组间差异；基于Bray-Curtis距离进行PCoA分析，结合ANOSIM检验评估微生物群落结构相似性及组间差异显著性；采用LEfSe分析（LDA阈值>3.5，P<0.05）识别各组从门到属层级上的显著丰度差异的微生物类群。
2 结果与分析
2.1 不同年限短萼黄连根内及根际微生物测序数据统计
从30个根组织和土壤样本中分别获得1 335 630条和1 149 786条细菌优化序列，平均长度分别为377 bp和256 bp。通过97%相似度聚类，高质量序列共分别聚类成6 102个和13 304个细菌OTUs。真菌ITS测序结果显示，根组织和土壤样本分别获得1 526 973条和762 136条真菌优化序列，平均长度分别约为 257 bp和238 bp，最终分别聚类为1 675个和4 214个OTUs。无论是细菌还是真菌群落，根组织样本的有效序列均高于根际土壤样本，但OTUs数目则显著低于根际土壤样本。
通过构建稀释曲线发现，随着抽取序列数的增加，曲线在达到一定高度后趋于平稳（图1），表明测序的深度足以覆盖样品中的大多数细菌和真菌种类，并且样本数量可满足后续生物信息学分析的需求。
图
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不同生长年限短萼黄连根内和根际土壤细菌（A、B）和真菌（C、D）的稀释曲线
Fig.
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Dilution curves for bacteria (A, B) and fungi(C, D) in roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala in different growth years
2.2 不同年限短萼黄连根内及根际微生物群落多样性分析
供试样本的微生物群落的丰度指数（Ace、Chao 1）和多样性指数（Shannon、Simpson）见表1。无论在根组织样本还是根际土壤样本中，随着生长年限的增加，细菌的Ace指数和Chao 1指数无显著变化，而细菌Shannon指数呈下降趋势，Simpson指数呈上升趋势，说明生长年限对细菌群落丰度影响不大，但对细菌多样性影响显著。
表
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根内和根际微生物多样性指数
Table
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Diversity indices of microbial communities in roots and rhizosphere soils
注：Root1、Root2、Root3分别对应一年生、两年生和多年生的根样本；RS1、RS2、RS3分别对应一年生、两年生和多年生的根际土壤样本。数值后的不同字母表示组内不同年限样本间差异显著（P＜0.05）。
Note: Root1, Root2, Root3 correspond to 1-year-old, 2-year-old, and perennial root samples, respectively; RS1, RS2, RS3 correspond to 1-year-old, 2-year-old, and perennial soil samples, respectively. Different letters after values indicate significant differences among samples of different years within the group(P＜0.05).
在真菌方面，随着生长年限的增加，根内真菌的Ace指数和Chao 1指数无显著性差异，而Shannon指数和Simpson指数呈先降后升趋势。根际土壤中真菌Ace和Chao 1指数逐年升高，但在两年生和多年生间无显著性差异；Shannon指数和Simpson指数变化不显著，说明所选生长年限的短萼黄连对根际土壤中真菌的多样性作用较小。进一步比较同一年限短萼黄连根内和根际微生物多样性指数，结果显示，无论是细菌还是真菌，根际土壤中的Ace指数、Chao 1指数和Shannon指数均显著高于根组织样本，说明其微生物物种丰富度和多样性高于根内生菌。
2.3 不同年限短萼黄连根内和根际土壤样品比较分析
基于Bray-Curtis算法，利用主坐标（principal co-ordinates analysis，PCoA）进行基于OTUs水平的微生物群落组成相似度分析。经ANOSIM检验表明，在细菌水平上，同一生长年限短萼黄连根和根际土样本中细菌聚集在一起，不同生长年限的样本分离（根：R2=0.695，P=0.001；根际土：R2=0.700，P=0.001），解释率分别为49.36%和43.16%（图2：A、B）。在真菌水平上，同一生长年限根内真菌没有聚在一起，组间不能很好分离（图2：C）。然而，同年根际土RS1、RS2、RS3样本聚集在一起，不同年限之间样本可分离（R2=0.828，P=0.001），组间差异显著可见，解释率为43.46%（图2：D）。
图
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不同生长年限短萼黄连根内和根际土中细菌(A、B)和真菌(C、D)的 PCoA 图
Fig.
2
PCoA plots of bacteria (A, B) and fungi(C, D) in roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala in different growth years
2.4 不同年限短萼黄连根内和根际细菌群落特征分析
2.4.1 细菌群落结构分析
在短萼黄连根和根际土壤中分别获得6 102个和13 304个细菌OTUs。其中，根组织中分类地位明确的细菌有32门97个纲228个目408个科814个属1 627个种；根际土壤中分类地位明确的细菌有51门156个纲380个目625个科1 207个属2 770个种。为了解不同组别独有和共有的物种数量，绘制了OTUs和属水平下的物种韦恩图。OTUs韦恩图显示，Root1、Root2和Root3中有1 692个共有细菌OTUs，占各生长年限根内细菌OTUs总数的45.18%、45.28%和52.92%，特有的细菌OTUs分别有1 431个、1 114个和732个（图3：A）。根际土壤中有5 196个共有细菌OTUs，分别占各生长年限细菌OTUs总数的54.54%、59.73%和60.20%，这说明随着生长年限的增加，根际土壤中特有的细菌OTUs数量呈下降趋势，一年生根际土壤中独有的细菌OTUs类型最多，为2 484个（图3：B）。
在门分类水平上，根样本中以变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和黏球菌门（Myxococcota）为主要优势细菌门，其中变形菌门的丰度随年限增加而增加，占比分别为48.82%、72.44%和75.27%（图3：E）。在根际土壤中，优势菌门为变形菌门、酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门，其中变形菌门丰度占比先降后升，在RS1中最高，酸杆菌门丰度占比逐年升高，而放线菌门丰度占比逐年下降（图3：F）。
在属水平上，Root1、Root2和Root3中共有细菌493个，独有细菌分别有70个、73个和42个（图3：C）。进一步分析细菌群落组成结构，发现根样本中主要以慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、根瘤菌属菌群（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）和生丝微菌属（Hyphomicrobium）等组成（图3：G）。其中，慢生根瘤菌属、根瘤菌属菌群、Steroidobacter、贪噬菌属（Variovorax）的相对丰度随着短萼黄连生长年限的增加而增加。值得注意的是，假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、链霉菌属（Streptomyces）、Galbitalea、细杆菌属（Microbacterium）等在Root1中相对丰度较高，但是在Root2、Root3中丰度极低。在根际土壤中，共有772个细菌属，RS1、RS2、RS3分别有200个、51个、38个独有细菌属（图3：D）。共有细菌属中相对丰度较大的依次为norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、norank_f_Xanthobacteraceae和慢生根瘤菌属（图3：H）。norank_f_Nitrososphaeraceae、norank_f_Vicinamibacteraceae、norank_f_norank_o_norank_c_bacteriap25、芽孢杆菌属（Bacillus）在Root2、Root3中相对丰度高；而norank_f_norank_o_Gaiellales在Root1中相对丰度较高。
图
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短萼黄连根内和根际土壤中细菌群落分析
Fig.
3
Analysis of bacteria communities in roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala
2.4.2 细菌群落标志物种分析
通过对短萼黄连根内和根际土壤细菌测序结果进行LEfSe分析（LDA阈值>3.5），分别获得了25个和7个差异显著的细菌属（图4：A、C）。Root1、Root2、Root3中各有8个、6个、11个差异显著菌属，其中在Root1中显著富集的Top 3菌属是游动放线菌属（Actinoplanes）、假诺卡氏菌属、链霉菌属，在Root2中是生丝微菌属、norank_f_SC-I-84、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），在Root3中是慢生根瘤菌属、Steroidobacter、Tardiphaga（图4：B）。RS1、RS2、RS3中分别有3个、2个、2个显著差异菌属，RS1中最富集菌属为MND1、鞘脂单胞菌属、unclassified_f_Comamonadaceae，RS2中为norank_f_norank_o_norank_c_bacteriap25和norank_f_Nitrososphaeraceae，RS3中为慢生根瘤菌属和Candidatus_Xiphinematobacter（图4：D）。
图
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不同生长年限短萼黄连根内（A、B）和根际土壤（C、D）中细菌LEfSe分析
Fig.
4
LEfSe analysis of bacteria in roots (A, B) and rhizosphere soils(C, D) of Coptis chinensis var. brevisepala in different growth years
2.5 不同年限短萼黄连根内和根际真菌群落特征分析
2.5.1 真菌群落结构分析
从短萼黄连根组织样本中共获得1 675个真菌OTUs，分布在12门49个纲126个目268个科483个属619个种；根际土壤样本中获得4 214个OTUs，分布在14门67个纲167个目420个科908个属1 378个种。OTUs韦恩图显示，Root1、Root2和Root3中共有172个真菌OTUs，独有真菌OTUs分别为565个、239个、372个（图5：A）。根际土壤样本中共有真菌OTUs数量为624个，分别占各生长年限总数的40.52%、26.11%和23.22%。随着生长年限的增加，根际土壤中特有真菌OTUs数量呈上升趋势，RS3中独有的真菌OTUs最多，为1 024个（图5：B）。
为进一步阐明不同生长年限短萼黄连根组织和根际土壤样本中菌群结构差异，对丰度Top 10的优势真菌门和Top 30的优势真菌属的组成结构和相对丰度变化进行分析，结果如图5：E-H所示。在排除未分类和其他真菌分类外，根组织中的优势真菌门主要有子囊菌门（Ascomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、担子菌门（Basidiomycota）（图5：E）。其中，子囊菌门丰度占比最高，分别为59.07%、48.67%、59.52%。根际土壤中的优势真菌门主要由子囊菌门、担子菌门和被孢菌门（Mortierellomycota）等组成（图5：F）。其中，子囊菌门和被孢菌门的丰度随着年限的增加呈先升后降的趋势，在RS2中比例最高，分别达到75.21%和4.99%，而担子菌门的丰度在RS1中占比最高，达10.44%，在RS2和RS3间差异不大。
在属水平下，Root1、Root2、Root3中共有真菌115个，独有真菌分别有145个、49个、69个（图5：C）。共有真菌主要为未分类真菌属（unclassified_k_Fungi）、Leptodophora、Tetracladium_f_Helotiaceae、unclassified_f_Plectosphaerellaceae和Titaea（图5：G）。在根际土壤中，共有真菌315个，独有真菌分别有77个、129个、141个（图5：D），主要优势真菌属为未分类真菌属、Epicoleosporium、unclassified_o_Helotiales、Cryptosporiopsis、木霉属（Trichoderma）（图5：H）。其中，尽管Epicoleosporium在各年限样本中占比均较高，但是其相对丰度随着短萼黄连生长不断下降。上述结果表明，随着短萼黄连的生长，根内和根际土壤中的真菌群落结构发生了一定的改变。
图
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短萼黄连根内和根际土壤中真菌群落分析
Fig.
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Analysis of fungi communities in roots and rhizosphere soils of Coptis chinensis var. brevisepala
2.5.2 真菌群落标志物种分析
真菌LEfSe分析（LDA阀值> 3.5）显示，在根组织和根际土壤中分别鉴定到16个和23个优势真菌属（图6：A、C）。其中，Root1、Root2、Root3中分别有11个、0个、5个，Root1中优势真菌属为unclassified_o_Pleosporales、Epicoleosporium、刺盘孢属（Colletotrichum）等，Root3 中为酵母属（Saccharomycopsis）、Ilyonectria、Ceratobasidiaceae_gen_Incertae_sedis（图6：B）。在根际土壤样本中，RS1、RS2、RS3中分别有6个、9个、8个差异显著真菌属，其中RS1中优势真菌属有Epicoleosporium、unclassified_f_Mycosphaerellaceae、Tricellula等，RS2中有Plectosphaerella、unclassified_o_Pleosporales、Apiospora等，RS3中有木霉属、杯盘菌属（Ciboria）、Cryptosporiopsis等（图6：D）。
图
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不同生长年限短萼黄连根内（A、B）和根际土壤（C、D）中真菌LEfSe分析
Fig.
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LEfSe analysis of fungi in roots (A, B) and rhizosphere soil(C, D) of Coptis chinensis var. brevisepala in different growth years
3 讨论与结论
3.1 根内和根际微生物群落结构特征及比较分析
在本研究中，同一生长年限的短萼黄连根际微生物的总OTUs数目、独有OTUs数目、共有OTUs数目以及多样性指数Ace、Chao 1和Shannon均显著高于根内生菌群，说明短萼黄连根际微生物群落的丰富度与多样性均高于根内生菌。根内与根际微生物相互作用构成了一种复杂的动态生态关系。有研究表明，根际微生物的群落丰富度与多样性显著高于根内生菌群，如项小燕等（2024）通过研究大别山五针松根际微生物和内生菌群落特征，发现根际微生物的总OTUs数目和α多样性指数均明显大于根内生菌，与本研究结果一致。
有研究推测，植物体内部分内生菌源自土壤，土壤微生物通过侵入宿主植物并与之共同进化，逐渐演变为内生菌。因此，植物内生菌与根际微生物在种类多样性方面存在一定的相关性。在特定条件下，植物内生菌与根际微生物还可实现相互转变。例如，Ju等（2020）研究发现，醉马草的内生真菌Epichloë gansuensis对其根际微生物群落的多样性与丰富度具有显著影响；Chen等（2022）通过对淫羊藿不同生长阶段叶内生真菌和根际土壤微生物的多样性分析，发现两者之间存在相互转变的现象。本研究通过对短萼黄连根内和根际土壤中微生物组成的比较分析发现，变形菌门和放线菌门均为二者共有的优势细菌菌门，其中变形菌门的丰度占比最高；子囊菌门、担子菌门和被孢菌门为二者共有的优势真菌菌门，其中子囊菌门为第一优势真菌菌门，这与梁浩等（2022）在雅连中的研究结果一致，同时也进一步验证了栖息地核心微生物一致的观点（Markov & Laudet，2022）。综上认为，短萼黄连根际土壤微生物的丰富度及多样性显著高于根内生菌群，但二者在核心菌门组成上具有相似性。
3.2 生长年限对短萼黄连根内及根际微生物群落特征的影响
比较不同生长年限短萼黄连根内及根际土壤微生物多样性，发现其微生物群落结构和组成存在显著差异。特别是在第一年至第二年间，根组织和根际土壤中微生物群落的组成与多样性发生了显著变化，成为群落结构转变的关键期。此外，短萼黄连根际土壤中细菌的指数Ace、Chao 1和Shannon明显高于真菌，而Simpson指数则显著低于真菌，说明短萼黄连根际土壤中细菌物种比真菌更为丰富且多样性较高，属于健康的“细菌型”土壤。随着短萼黄连生长年限的增加，根际土壤中细菌的数量与多样性逐渐下降，真菌的数量和多样性则逐步增加，表明根际土壤正在经历由“细菌型”向“真菌型”的转变，这与刘成（2024）关于黄连连作显著降低根际土壤细菌数量并提高真菌数量的研究结果相契合。值得注意的是，随着生长年限的增加，根内生菌的丰度及多样性变化趋势与根际微生物一致，表明生长年限也能显著影响根内生菌环境。研究显示，根系分泌物在根际土壤的理化性质、根表面及随后根组织内部的微生物群落方面发挥着多重积极作用（张丹等，2015；Zhuang et al., 2024）。在黄连种植过程中，根部会不断向土壤中释放酚酸类化感物质，土壤内酚酸类化感物质浓度逐年上升，最终引起土壤微生态环境的改变（刘云露，2019；刘成，2024）。在短萼黄连与黄连中，根际微生物群落多样性和结构组成的变化规律一致，可能与两者的根系分泌物相似有关，但其参与植物-微生物相互作用的具体机制还不确定，仍有待进一步研究。
随着短萼黄连生长年限的增加，其根部优势细菌的丰度比例发生了较大变化。然而，在根际土壤中，变形菌门和酸杆菌门始终在细菌丰度占比最大，这与冼康华等（2022）在不同生长年限华重楼根际土壤细菌类群特征的研究规律保持一致。游动放线菌属和链霉菌属为常见放线菌，在土壤有机质的转化方面起着重要作用。游动放线菌属和链霉菌属是Root1中的核心优势属，在Root1中丰度最高，这意味着它们可能是促进短萼黄连早期生长的关键菌属。根瘤菌属是一种植物促生菌，具有产生生长素、乙烯等植物激素和解磷等作用，能够促进植物生长（霍佳慧等，2022）。本研究中，慢生根瘤菌属以较高丰度存在于短萼黄连所有样本中且随着短萼黄连的生长其丰度不断富集，是Root3和RS3中占主导地位的菌属，说明该菌属可能在短萼黄连生长和环境适应中发挥了关键作用，但还需进一步验证。拟孢囊菌属（Kibdelosporangium）和微杆菌属（Mycobacterium）是稀有放线菌属，具有特异性次级代谢潜力（Ma et al., 2024）；Steroidobacter是一种与土壤氮代谢密切相关的菌属（Xun et al., 2021），这些菌属在Root3中显著富集，推测可能与短萼黄连后期生长及次生代谢相关。真菌LEfSe分析显示，Epicoleosporium是Root1和RS1中的优势真菌群落。Epicoleosporium包含多种植物病害真菌，这表明Epicoleosporium可能是短萼黄连早期生长阶段的主要病原体。Plectosphaerella作为多种植物的病原体而广为人知，它们会导致果实、根部和颈部腐烂塌陷（Carlucci et al., 2012）。Gibellulopsis中唯一有效物种被证明是中国甜菜枯萎病的病原菌（Zhou et al., 2017）。本研究中，Plectosphaerella和Gibellulopsis分别显著存在于RS2和RS3中，表明这两个菌属可能是短萼黄连中后期发病的主要原因。综上所述，短萼黄连在不同生长阶段可能受特定有益菌株（一年生为游动放线菌属；两年生和多年生为慢生根瘤菌属）与有害菌株（一年生为Epicoleosporium；两年生为Plectosphaerella；多年生为Gibellulopsis）的影响，进而构建起植物-微生物动态互作关系。
本研究通过分析短萼黄连根内生菌和根际微生物群落特征，阐明了根内和根际微生物在群落结构与组成特征上的异同点；通过揭示不同生长年限根内和根际微生物多样性的动态变化规律，明确了生长年限对短萼黄连根内和根际微生物多样性的影响。本研究结果表明，特定的有益微生物（一年生为游动放线菌属；两年生和多年生为慢生根瘤菌属）可能在短萼黄连不同生长阶段发挥关键作用，为后续探讨短萼黄连生长发育与微生物的相互作用，分离有益微生物等提供了理论依据。对不同年限短萼黄连病原菌（一年生为Epicoleosporium；两年生为Plectosphaerella；多年生为Gibellulopsis）的研究，也能为今后短萼黄连的病虫害防治和科学栽培奠定基础，促进短萼黄连的科学保护和可持续发展。此外，本研究仅针对浙江清凉峰国家级自然保护区的短萼黄连种群展开，所得结论可能存在一定的局限性。因此，未来应尽可能扩大采样范围，覆盖更多分布区域，以验证结论的普适性，为完善短萼黄连种群保护策略提供更全面的数据支持。