摘要
萜类合酶(TPS)是合成萜类物质的关键酶，可以催化同一萜类前体物质形成不同的萜类骨架，也可以作用于多种底物，从而产生多样的萜类化合物。该研究通过生物信息学方法对厚朴MoTPS基因家族成员进行鉴定，并综合分析其理化性质、染色体定位、系统进化关系、保守基序、基因结构和顺式作用元件等，基于厚朴根、茎、叶、果实及不同发育时期厚朴花转录组数据，分析其在厚朴不同部位及不同时期厚朴花中的组织特异性及表达模式。结果表明：（1）在厚朴中共鉴定出55个MoTPS家族成员且47个成员分布在10条染色体上。（2）保守基序及基因结构分析表明，MoTPS蛋白属于Class ⅠTPS，基序数量在1~11个之间且所有成员均包含典型的TPS保守基序，但不同MoTPS基因的内含子数量差异较大。（3）系统进化分析表明，MoTPS 共分为5个亚家族，其中TPS-a亚家族成员占比最高，为58.18%。（4）顺式作用元件分析表明，启动子区域包括光响应、激素调节、环境胁迫、植物生长发育、代谢等顺式作用元件，MoTPS基因在厚朴不同部位及不同发育时期厚朴花中的表达量存在显著性差异，表明MoTPS基因在厚朴各部位及不同花期可能存在功能的分化。该研究结果为深入探究厚朴MoTPS基因的功能，以及解析其在厚朴花香气物质生物合成和调控机制中的作用奠定了基础。
Abstract
Terpenoid synthase (TPS) is a key enzyme in terpenoid biosynthesis, catalyzing the formation of diverse terpene skeletons from common precursors and also acting on multiple substrates, thereby producing a wide array of terpenoid compounds. In this study, we identified MoTPS gene family members in Magnolia officinalis using bioinformatics approaches and systematically analyzed their physicochemical properties, chromosomal localization, phylogenetic relationships, conserved motifs, gene structures, and cis-acting elements. Based on transcriptome data from roots, stems, leaves, fruits, and flowers at different developmental stages, we further investigated their tissue specificity and expression patterns in different tissues and at different floral developmental stages. The results were as follows: (1) A total of 55 MoTPS family members were identified, and 47 members were distributed on 10 chromosomes. (2) Conserved motif and gene structure analyses revealed that MoTPS proteins belong to Class I TPS, containing 1-11 motifs, with all members harboring typical TPS conserved motif. However, the number of introns varied significantly among different MoTPS genes. (3) Phylogenetic analysis showed that MoTPS were divided into five subfamilies, with the TPS-a subfamily having the highest proportion of members at 58.18%. (4) Cis-acting element analysis showed that the promoter region included cis-acting elements for light response, hormone regulation, environmental stress, plant growth and development, and metabolism, etc. Expression profiling showed significant variations in MoTPS genes expression across different tissues and floral developmental stages, suggesting functional diversification of MoTPS genes in M. officinalis. This study provides a foundation for further functional characterization of MoTPS genes in M. officinalis and elucidates their roles in the biosynthesis and regulation of floral fragrance compounds.
厚朴(Magnolia officinalis)为木兰科木兰属植物，兼具观赏价值与药用价值，其树皮（包括干皮、根皮、枝皮）均可作药用(国家药典委员会，2020)。除药用功能以外，厚朴还因其独特的芳香特性日益受到关注，其香气成分主要源于丰富的萜类化合物且厚朴不同组织及不同花期所含的萜类物质种类与含量差异显著，花蕾期的厚朴花挥发油成分主要为醇类、芳香烃类和烷烃类，而盛开期则以萜烯类物质为主，花蕾期挥发油中萜烯类物质的成分相对含量仅为0.59%，而开花期含量为59.02%（何郡等，2018）。虽然厚朴花市场交易量不大，但其香气浓郁，这些香气成分在香料、化妆品和保健品等领域极具应用价值(杨海清，2013; 麻杰等，2018; Anandakumar et al., 2021)。因此，探究厚朴中萜类物质的合成机制，对于提升其经济价值和应用潜力具有重要意义。
萜类化合物是植物次生代谢产物的重要组成部分，不仅构成了花香物质的基础，还在植物与环境互作中发挥着重要作用，如抗病虫害、调节生理代谢等(李彦等，2012)。萜类化合物的生物合成分为两条途径，受到多种酶的调控，其中同时参与两条途径的核心酶为萜类合酶（terpenoid synthase，TPS），TPS以香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate, GPP)、法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP)为底物合成单萜、倍半萜、二萜(常晋等，2024)。TPS可以催化同一萜类前体物质形成不同的萜类骨架，也可以作用于多种底物，从而产生多样的萜类化合物。
TPS家族是一个中等大小的家族，通过对已鉴定功能的TPS进行聚类分析，TPS基因家族包含TPS-a、b、c、d、e/f、g、h 7个亚家族(Bohlmann et al., 1998)。根据其编码的酶形成产物的能力，TPS主要分为编码单萜合酶、倍半萜合酶和二萜合酶，分别合成单萜、倍半萜和二萜。根据TPS结构和反应机制的不同，可分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类：Class Ⅰ存在于几乎所有植物中，该类TPS包含“DDXXD”和“NSE/DTE”基序，这些保守基序的作用为最初酶反应中电离二磷酸戊烯基形成碳正离子中间体(刘琬菁等，2017)，其显著特点为不同碳正离子中间体形成时随机重排，因此单个酶作用于单个底物时可以产生多样化产物(Steele et al., 1998)；Class Ⅱ类TPS活性残基存在独立的结构域并且包含“DXDD”基序，该区域用于起始质子环化作用。TPS在植物中广泛存在，目前已在拟南芥(Arabidopsis thalianan)(Aubourg et al., 2002)、水稻(Oryza sativa)(Zang et al., 2011)、番茄(Solanum lycopersicum)(Zhou & Pichersky, 2020)和马铃薯(S. tuberosum)(Xu et al., 2017)等物种中被系统鉴定和研究，但是对厚朴中TPS基因家族的研究较少，限制了对其香气合成机制的深入理解。
本研究以厚朴为研究材料，采用生物信息学方法，通过对MoTPS基因家族的理化性质、基因结构、系统进化及表达模式进行分析，拟探讨以下问题:（1）厚朴中MoTPS基因家族成员的数量、染色体位置分布及理化性质；（2）MoTPS基因家族成员的系统进化树、保守结构域、基因结构、顺式作用元件等；（3）明确MoTPS基因家族成员在厚朴不同部位及不同发育阶段厚朴花中的表达模式。本研究对进一步解析厚朴MoTPS基因的功能及其作用机制具有重要参考意义，也为厚朴的资源开发提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
2024年5月在都江堰市龙池镇虹口乡（103°41′4.13″E、31°08′3.79″N）采集3个不同花期的厚朴花，花期的区分参考王洁等（2011）的方法，将其分为初花期(a)、展瓣期(b)、盛花期(c)。经成都中医药大学高继海副教授鉴定为厚朴的花，使用液氮将其速冻，于-80 ℃冰箱保存备用，用于转录组测序及qRT-PCR 验证。
图
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不同发育时期的厚朴花
Fig.
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Magnolia officinalis flowers at different development stages
1.2 MoTPS基因家族成员的筛选与鉴定
为鉴定MoTPS基因家族成员，从GenBank下载厚朴基因组、注释文件（PRJNA752832、PRJNA752923）（Yin et al., 2021），使用TBtools生物信息学软件(Chen et al., 2020)提取MoTPS，拟南芥AtTPS和水稻OsTPS蛋白序列分别在TAIR网站(www.arabidopsis.org)和RGAP(http://rice.uga.edu)下载，以AtTPS和OsTPS蛋白序列为参考，采用BLASTP的方法，搜索MoTPS的蛋白序列(e值≤1×10-5，相似度>50%)。同时从Inter Pro数据库(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)中下载PF01397、PF03936的隐马尔科夫模型(HMM)文件，利用TBtools中的HMMER筛选厚朴中的TPS蛋白(e值≤1×10-5，相似度>50%)，得到MoTPS候选蛋白序列。
1.3 MoTPS家族成员理化性质分析
使用ExPASy网站(http://cn.expasy.org/tools)分析MoTPS的氨基酸数、相对分子质量、等电点、不稳定系数、脂肪系数和总平均亲水指数。
1.4 MoTPS家族成员的染色体定位
利用厚朴基因组注释信息获得MoTPS基因的染色体位置，使用TBtools绘制MoTPS基因在染色体上的分布图。使用Tandem Repeats Finder(v4.09)（Benson, 1999）鉴定串联重复序列，参数设置如下：Match=2, Mismatch=7, Delta=7, PM=80, PI=10, Minscore=50, MaxPeriod=2 000。
1.5 MoTPS家族成员的系统进化树构建
使用MEGA（12.0.9）软件（Kumar et al., 2024）利用最大似然法(maximum likelihood, ML) 构建厚朴、拟南芥（Aubourg et al., 2002）、望春花(Dong et al., 2021)的系统进化树，Bootstrap值设置为1 000。
1.6 MoTPS家族成员的保守基序、结构域及基因结构分析
通过MEME在线网站(http://meme-suite.org)分析MoTPS家族成员的保守基序，基序数量设置为20，其余参数默认，获得MoTPS保守基序信息，并使用TBtools中的Visualize Motif Pattern(from meme.xlm/mast.xlm)模块进行可视化。使用NCBI CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd) 分析MoTPS的保守结构域，使用TBtools中的Visualize Domain Pattern(from NCBI Batch-CDD)模块进行可视化。通过厚朴基因组的GFF注释文件，获取MoTPS基因家族成员外显子的位置，采用TBtools中的Gene Structure Shower模块进行可视化。
1.7 MoTPS家族成员的顺式作用元件分析
使用TBtools提取MoTPS基因上游2 000 bp启动子序列，将启动子序列上传到PlantCARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测其顺式作用元件，使用TBtools对预测得到的顺式作用元件进行分析及可视化。
1.8 RNA-seq分析MoTPS基因的组织表达模式
基于厚朴根、茎、叶、果实及不同时期花的转录组数据（GenBank：PRJNA752832、PRJNA752923）（Yin et al., 2021），对转录组数据进行有参分析，得到每个转录本的每千个碱基的转录每百万映射读取的片段（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments, FPKM）值，基于该值使用TBtools绘制MoTPS在厚朴不同部位及不同花期中的表达量热图。
1.9 qRT-PCR分析MoTPS在不同时期厚朴花中的表达量
选取6个在盛花期中表达量高的基因进行qRT-PCR验证，6个基因为MoTPS42、MoTPS41、MoTPS40、MoTPS43、MoTPS24、MoTPS13，以初花期、展瓣期、盛花期的厚朴花cDNA为模板，参考周罗静（2023）的实验方法，以Actin为内参基因（李永宁等，2023），使用Primer Premier 5软件设计qRT-PCR特异性引物(表1)。采用SsoFastTMEva Green Su-peremix(Bio-Rad, USA)进行定量表达检测，用2-△△Ct方法计算基因的相对表达量（李永宁等，2023）。
表
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qRT-PCR扩增特异性引物
Table
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Specific primers of qRT-PCR amplification
2 结果与分析
2.1 MoTPS基因家族成员的鉴定和蛋白理化性质
以拟南芥和水稻TPS蛋白为参考，通过BLASTP和HMMER，在厚朴全基因组中共鉴定到55个MoTPS家族成员，根据它们在染色体上的位置分布（王月雪等，2025），依次命名为MoTPS1-MoTPS55。理化性质分析结果（表2）表明，MoTPS的氨基酸数为111~796 aa，氨基酸数平均为439.49 aa，最大的为MoTPS1。蛋白相对分子质量为12 723.02~90 454.60 Da，平均相对分子质量为50 625.36 Da，等电点为4.68~8.99，平均为5.82，其中48个成员为酸性蛋白，7个成员为碱性蛋白。不稳定系数为23.06~53.39，其中有26个蛋白为稳定蛋白，29个蛋白不稳定系数大于40，为不稳定蛋白，脂肪系数为76.21~117.75，MoTPS家族的55个成员中，有52个成员为亲水蛋白，MoTPS2、MoTPS31和MoTPS40为疏水蛋白。
表
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MoTPS基因家族成员蛋白序列信息
Table
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Protein sequence information of MoTPS gene family members
2.2 MoTPS基因家族成员的染色体定位
通过厚朴基因组注释，绘制MoTPS基因家族成员的染色体定位图谱，结果(图2)显示厚朴MoTPS家族的47个成员分布在10条染色体上，其中有23个基因定位到17号条染色上，8个成员未定位到染色体上，这些基因未定位到染色体上的原因可能是基因为重复序列，如转座子、串联重复序列，导致基因难以准确定位（Treangen & Salzberg, 2011）。在2、3、12、16、17号染色体上存在基因簇，形成基因簇的MoTPS基因存在串联重复。
图
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MoTPS基因家族成员在染色体上的分布
Fig.
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Distribution of MoTPS gene family members on chromosomes
2.3 MoTPS家族成员的系统进化树构建
为了阐明厚朴MoTPS蛋白的进化关系，构建了拟南芥、望春花和厚朴3个物种共191个TPS蛋白的系统发育树，结果(图3)显示，厚朴MoTPS家族可分为TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e/f、TPS-g 5个亚家族，其中TPS-a亚家族所包含的MoTPS最多，有32个，占总数的58.18%，其次为TPS-b亚家族有15个，TPS-g亚族有2个成员，TPS-c亚族有1个成员，TPS-e/f家族有5个成员。未定位到染色体上的MoTPS48、MoTPS49、MoTPS50、MoTPS51、MoTPS53、MoTPS54和MoTPS55均属于TPS-a亚族，MoTPS52属于TPS-b亚族。
图
3
拟南芥、望春花和厚朴TPS蛋白系统进化树
Fig.
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Phylogenetic tree of TPS proteins in Arabidopsis thaliana, Magnolia biondii and M. offinalias
2.4 MoTPS家族成员的保守基序、结构域及基因结构分析
对MoTPS的保守基序、结构域和基因结构进行分析，结果如图4所示。保守基序分析（图4：A）发现，MoTPS1-MoTPS55蛋白中保守基序的数量在3~18个之间且大多基序为5个亚家族所共有，如Motif 3、Motif 2和Motif 5等是55个MoTPS蛋白中的常见基序，表明这些基序在MoTPS中较保守，而Motif 19只存在于TPS-c和TPS-e/f亚家族中，Motif 20只存在于 TPS-c亚家族中。基因结构域分析（图4：B）表明，MoTPS均只包含1个保守结构域，其中包含基因数目最多的结构域为萜烯环化酶，有29个MoTPS成员，其次为反式异戊烯基磷酸合酶和Ⅰ类萜烯环化酶超家族，有12个MoTPS成员，除此之外，有4个MoTPS成员的结构域为萜烯合成酶。对MoTPS基因结构进行分析（图4：C）发现，MoTPS的内含子数目在1~11个之间，其中MoTPS31、MoTPS36、MoTPS45、MoTPS21和MoTPS50仅有1个内含子，大多数MoTPS含有6个内含子，MoTPS1、MoTPS44、MoTPS12和MoTPS13含有11个内含子且MoTPS的外显子长度也存在差异。
图
4
MoTPS家族成员的保守基序、结构域及基因结构分析
Fig.
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Analysis of conserved motif, domain and gene structure of MoTPS family members
2.5 MoTPS家族基因成员的顺式作用元件分析
利用PlantCARE分析厚朴MoTPS基因家族启动子的顺式作用元件，一共获得22类顺式作用元件，其中出现次数最多的为启动子和增强子区域，共出现771次，其次为光响应元件592次。顺式作用元件按功能可分为四类，即与激素调节相关、与环境胁迫相关、与发育和组织特异性调控相关及与代谢调控相关（图5）。其中，与激素调节相关的顺式作用元件有赤霉素响应(63次)、水杨酸反应(253次)、茉莉酸甲酯（MeJA）响应(176次)；与环境胁迫相关的顺式作用元件有厌氧诱导(105次)、干旱诱导(60次)、低温响应(50次)及防御和应激反应(25次)；与发育和组织特异性调控相关的有胚乳表达(19次)、分生组织表达(35次)和种子特异性调控(8次)；与代谢调控相关的元件有生长素响应(57次)、黄酮类生物合成基因调控(4次)和玉米蛋白代谢调控(54次)。
图
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MoTPS基因家族成员启动子顺式作用元件分析
Fig.
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Cis-acting elements analysis of MoTPS gene family member promoters
2.6 利用RNA-seq分析MoTPS基因表达模式
基于55个MoTPS基因在花、干皮、叶片、根皮、果实及初花期、展瓣期、盛花期厚朴花中的表达量，绘制了表达量热图。图6结果表明，MoTPS在厚朴不同部位的表达量存在显著性差异，在花中表达量高的基因有6个属于TPS-a亚家族，8个属于TPS-b亚家族，1个属于TPS-c亚家族；在干皮中表达量高的12个基因中，11个为TPS-a亚家族成员，1个为TPS-b亚家族成员；在叶片中表达量高的9个基因分别来源于TPS-a、TPS-e/f和TPS-g亚家族；在根皮中表达量高的6个基因分别来源于TPS-a、TPS-b和TPS-g亚家族；在果实中表达量高的5个基因分别来源于TPS-a、TPS-b和TPS-e/f亚家族。此外，大多数基因仅在1个部位高表达，仅有MoTPS46在花和果实中高表达，MoTPS10和MoTPS51同时在叶片和根皮中高表达，MoTPS48在花和叶片中高表达，MoTPS15在干皮和叶片中高表达。
MoTPS基因在不同花期表达量差异较大，大多数基因均仅在1个时期高表达，在初花期表达量高的13个基因中，8个属于TPS-a亚家族、1个属于TPS-b亚家族、1个属于TPS-e/f亚家族、2个属于TPS-g亚家族、1个属于TPS-c亚家族；在展瓣期高表达的3个基因均属于TPS-b亚家族；在盛花期高表达的11个基因中，6个属于TPS-a亚家族、3个属于TPS-b亚家族、2个属于TPS-e/f亚家族（图6）。
图
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MoTPS基因在厚朴不同部位及不同花期中的表达量热图
Fig.
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Heatmaps of MoTPS gene expression in different parts of Magnolia officinalis and at different flowering stages
2.7 MoTPS基因在不同时期厚朴花中的表达量分析
为验证转录组数据的可靠性，随机选取 6 个在盛花期中表达量高的基因进行 qRT-PCR 验证，6 个差异表达基因的相对表达量与转录组数据的 FPKM 值变化趋势基本一致(图 7)，说明转录组数据结果可靠。
图
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差异表达基因qRT-PCR 验证
Fig.
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qRT-PCR validation of differentially expressed genes
3 讨论与结论
TPS是萜类物质生物合成途径中的关键酶，催化萜类前体转化成不同类型的萜烯骨架，决定萜类结构和功能的多样性(刘琬菁等，2017)。在厚朴中共筛选鉴定到55个TPS基因家族成员，分为5个亚家族，这与在望春花（Dong et al., 2021）、小麦(Liu et al., 2024)等物种中TPS基因家族的分布一致。其中，47个MoTPS基因不均匀地分布在10条染色体上，其中在第17号染色体上富集了23个基因，该区域可能为TPS家族成员扩张的重点区域。在5条染色体上存在基因簇，这些基因簇中的成员存在串联重复，表明基因复制事件在MoTPS家族扩张中发挥了重要作用，此外，在大豆、拟南芥、水稻中也分别有10、18、16个TPS基因存在串联重复（Li et al., 2024），基因复制事件在基因家族内部创造了多样性，对于理解物种的进化过程具有重要意义（Xu et al., 2020）。
大多数MoTPS蛋白共享多个保守基序，广泛存在于MoTPS中的Motif 2、Motif 3和Motif 5在MoTPS家族的结构和功能维持中具有重要作用，如Motif 3的功能为协调二价金属离子与底物二磷酸基团的结合，帮助反应底物定位；Motif 2为“RXR”，该结构域能够将二磷酸基团远离活性位点，从而防止其攻击中间体，确保酶促反应正常进行（Koksal et al., 2011）。然而，Motif 19和Motif 20仅特异性地存在于TPS-c和TPS-e/f亚家族中，提示不同亚家族在功能上可能存在分化，特异基序可能与特定的酶活性或底物识别相关（Chen et al., 2011）。尽管MoTPS蛋白结构存在多样性，但是多数基因仅含1个功能结构域，主要包括萜烯环化酶、反式异戊烯基磷酸合酶及Ⅰ类萜烯环化酶超家族等，这些结构域的存在与MoTPS家族成员在萜类化合物合成中的核心功能密切相关。MoTPS基因的内含子数量差异显著，从1至11个不等，说明其在进化过程中可能经历了复杂的基因重组或剪接事件。部分基因如MoTPS31和MoTPS50仅含1个内含子，可能代表进化中相对简化的成员；而MoTPS1和MoTPS13等含有11个内含子，其复杂结构可能为其功能多样性提供了结构基础（熊良林等，2025）。
启动子上的顺式作用元件是转录因子结合的区域，促进启动该基因的转录，并激活基因的表达调控（Kazuko& Kazuo, 2005）。通过顺式作用元件分析发现，厚朴MoTPS基因家族成员中含有大量与光响应、激素调节、环境胁迫、代谢调控相关、发育和组织特异性调控相关的顺式作用元件，分别出现了592次、492次、240次、115次、62次，这些元件可以通过与特定转录因子结合来实现下游基因的转录表达（孙天国等，2025），表明MoTPS基因的表达可能受到光照、激素、非生物胁迫及植物生长发育等多种因素的调控，这与Xu等（2024）的研究结果一致。然而，在其他物种中也有对TPS顺式作用元件的研究，例如：在水稻中OsTPS基因的表达在长时间低温条件下受到动态调控（Liu et al., 2024）；小麦中TaTPS在小麦应对超低温和低温条件中起着至关重要的作用（Liu et al., 2024）；在丹参的52个SmTPS基因中，有24受到茉莉酸甲酯的诱导表达，表明这些基因编码的蛋白质所催化的产物可能参与茉莉酸甲酯对丹参中不同萜类产物生物合成的诱导（高颖等，2024）。
表达模式分析结果显示，MoTPS基因在厚朴不同部位的表达量存在显著性差异，表明MoTPS基因可能存在功能的分化，在不同部位高表达的MoTPS基因其功能可能为调控该部位的生长发育及该部位次生代谢产物的生成。Liu等（2024）研究发现小麦中的TaTPS基因在应对非生物胁迫时能调控根系发育过程，过表达TaTPS基因能增强小麦的耐寒性。然而，在大豆花中表达量较高的GmTPS可能对花的发育有潜在的贡献（Li et al., 2024）。此外，在不同发育阶段的花中表达量存在显著性差异则表明MoTPS在花期调控中可能具有不同的功能。例如，MoTPS26、MoTPS33、MoTPS36基因表达量均在初花期较高，但在展瓣期和盛花期下降，并且它们的保守结构域均为反式异戊烯基磷酸合酶和Ⅰ类萜烯环化酶超家族，其功能可能为合成萜类前体物质，在展瓣期和盛花期被其他MoTPS基因或者酶类转化花香物质；MoTPS13、MoTPS42、MoTPS13、MoTPS4等基因在盛花期表达量较高，说明这些基因可能和花香物质合成直接相关。
综上，本研究共鉴定出55个MoTPS成员，分为5个亚家族，其中47个成员在染色体上呈现不均匀的分布，MoTPS蛋白在结构上具有一定的保守性与特异性，可能在响应光照、激素、胁迫以及参与厚朴植物各部位生长发育等过程中发挥关键调控作用，同时也参与厚朴香气物质合成，本研究结果为进一步解析厚朴MoTPS基因的生物学功能奠定了基础。