摘要
钩器官是药用植物钩藤的特殊结构，也是主要药用部位，与花序被认为属于同源器官，但是钩如何发育而来尚不清楚。为解析钩器官的来源及其发育机制，该研究通过RT-PCR及RACE技术克隆了3个钩藤MADS-box转录因子家族SEPALLATA（SEP）-like基因的完整编码区序列，并采用生物信息学预测、亚细胞定位、转录激活实验、RT-qPCR方法初步分析其功能。结果表明：（1）UrSEP1、UrSEP3.1、UrSEP3.2的全长cDNA序列长度分别为931、981、1 097 bp，编码区长度分别为738、726、729 bp，分别编码245个、241个、242个氨基酸，蛋白序列中均包含保守的MADS结构域、K-box、SEP Ⅰ 和SEP Ⅱ 基序。（2）系统进化树分析显示，UrSEPs与小粒咖啡CaSEPs的亲缘关系最近，其中UrSEP1属于LOFSEP亚类中的SEP1/2分支，UrSEP3.1和UrSEP3.2同属于SEP3亚类。（3）亚细胞定位发现，UrSEPs均定位于细胞核，说明UrSEPs在核中发挥作用，其中UrSEP1和UrSEP3.2具有转录激活活性，提示UrSEP1和UrSEP3.2能够直接结合DNA序列。（4）UrSEPs基因的RT-qPCR结果表明了钩与花序的同源性和二者发育上的分歧，UrSEP3.1和UrSEP3.2在钩中的转录水平均显著高于根、茎、叶，并且在钩与花序两种发育过程中具有类似的表达模式；UrSEP1在钩芽中的表达量明显上升，高于其他营养组织及花序芽，并在钩与花序发育过程中具有相反的表达模式。综上认为，UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2参与了钩的发育，并可能在钩和花序早期发育命运分歧中发挥作用。该研究从基因层面为揭示钩藤钩器官的来源提供了线索，为解析其形态建成的分子机制奠定基础。
Abstract
The hook is a distinctive structure of the medicinal plant Uncaria rhynchophylla, and serves as its primary medicinal part. Although the hook and inflorescence are considered to be homologous organs, the developmental mechanism of the hook remains unclear. To investigate the origin and the developmental mechanism of the hook, this study cloned the complete coding sequences of three SEPALLATA (SEP)-like genes, belonging to the MADS-box transcription factor family, by using RT-PCR and RACE techniques. The functions of these SEP-like genes were preliminarily characterized through bioinformatic prediction, subcellular localization, transcriptional activation assays, and RT-qPCR methods. The results were as follows: (1) The full-length cDNA of the three genes, UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2, were 931, 981, 1 097 bp in length, which contained the coding sequences (CDS) of 738, 726, 729 bp, encoding 245, 241, and 242 amino acid residues, respectively. All proteins contained conserved domains, including MADS domain, K-box, SEP Ⅰ and SEP Ⅱ motifs. (2) Phylogenetic tree analysis revealed that UrSEPs exhibit the closest relationship to CaSEPs from Coffea arabica. UrSEP1 clusters within the SEP1/2 clade of the LOFSEP subgroup, while UrSEP3.1 and UrSEP3.2 belong to the SEP3 subgroup. (3) Subcellular localization showed that UrSEPs were all localized in the nucleus and confirmed the nuclear activity of UrSEPs. Transcriptional activation assays suggested that UrSEP1 and UrSEP3.2 might exhibit transcriptional activation activities, indicating that they can bind DNA directly. (4) Results of RT-qPCR revealed potential homology between hook and inflorescence, alongside developmental divergence. UrSEP3.1 and UrSEP13.2 showed higher transcriptional levels in hook than in root, stem or leaf, with similar expression patterns during hook and inflorescence development; the expression level of UrSEP1 peaked in hook bud, surpassing levels in other vegetative tissues and inflorescence bud, and displayed opposing expression patterns during hook versus inflorescence development. In summary, the three UrSEPs genes encode nuclear-localized proteins from SEP1/2 and SEP3 clades, implicating their roles in hook development and early-stage fate divergence between hook and inflorescence. These results provide genetic insights into the origin of the hook and establish a foundation for elucidating the molecular mechanisms underlying hook morphogenesis in Uncaria rhynchophylla.
药用植物钩藤（Uncaria rhynchophylla）为茜草科钩藤属藤本植物，其药用部位为带钩茎枝，作为著名中药材和民族药材之一用于治疗高血压和神经系统疾病（邓宽平等，2021；涂冬萍等，2021；段建平等，2024），其中包含以钩藤碱和异钩藤碱为主的单萜吲哚类生物碱及三萜类化合物等活性成分，研究发现其具有保护神经细胞、调节神经递质、抑制铁死亡等作用（Qin et al., 2021; Liu et al., 2024）。钩藤的钩器官作为库，能够接收并储存叶中合成的生物碱（阙云飞等，2023）。邓宽平等（2021）通过对钩器官进行解剖学研究，提出其为茎侧枝变态发育而来，但与茎相比其结构更为简单，仅具有初生结构。长期以来的形态学研究认为钩藤的钩和花序是同源器官（Sperotto et al., 2020），并且Wan等(2023)在对单钩生长模式的转录组学研究中发现了4个花器官发育相关的基因，即AGAMOUS、SRS、GRP2和EMS1，为其提供了初步的分子证据。目前，关于钩藤钩器官的形态发生尚未有详细的基因层面研究报道，对于钩发育相关基因的分析能为阐明钩器官的来源提供进一步线索。
SEPALLATA（SEP）基因编码一类植物特有的MIKC型MADS-box转录因子，除MADS结构域以外，还包含I、K及C末端结构域，能够发挥“桥梁”的作用参与蛋白互作网络，与同为MADS-box转录因子的蛋白形成多种复合物，并直接结合下游基因启动子CArG-box序列上调控制其转录（Hugouvieux & Zubieta, 2018）。SEP是被子植物花发育经典ABCDE模型中的E-class基因，被分为SEP3（AGL9）和LOFSEP 2个亚家族，其中LOFSEP又被分为SEP1/2、FBP9/23和SEP4 3个分支（Dreni & Ferrándiz, 2022）。模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中共有4个SEP基因，分别为SEP1、SEP2、SEP3和SEP4，SEP蛋白与A-class蛋白互作控制萼片分化，与A-class和B-class蛋白形成复合物决定花瓣发育，通过介导B-class和C-class蛋白结合控制雄蕊分化，与C-class蛋白结合控制心皮形成，与C-class和D-class形成多聚体决定胚珠的发育（Wils & Kaufmann, 2017）。除了决定花器官分化外，SEP蛋白还广泛参与各类花序的发育过程，从而在被子植物生殖生长中发挥着核心作用。大麦（Hordeum vulgare）SEP-like蛋白HvMADS1通过细胞分裂素途径调控花序形态，并且该蛋白对于CArG-box基序的结合受环境温度影响（Li et al., 2021）；水稻（Oryza sativa）SEP-like基因OsMADS5和OsMADS34参与调控圆锥花序结构，过表达植株的花序二级分枝均受到抑制（Zhu et al., 2022）；番茄（Solanum lycopersicon）SEP-like基因SIMBP21在花序分生组织生长与分化中起到了关键作用，抑制其表达可促进植株花序生长并分化产生更多的花（Zhang et al., 2024）；非洲菊（Gerbera hybrida）的SEP-like基因在头状花序发生早期调控花序分生组织分化和花分生组织发生，并能够控制花序分生组织分化终止（Elomaa et al., 2018）；甘菊（Chrysanthemum lavandulifolium）的SEP-like基因在头状花序分生组织顶端隆起及小花原基形成初期均有高水平表达（Wen et al., 2022）；金盏菊（Tagetes erecta）的SEP-like基因在花序芽和花中高表达，并且能够使转基因拟南芥和烟草开花时间提前，转基因烟草的花序分枝减少（Zhang et al., 2021）；此外，二球悬铃木（Platanus acerifolia）中SEP-like基因在头状花序发育过程中表达，并促进转基因烟草花序二级分枝产生（Zhang S et al., 2017）。综上表明，SEP-like基因在不同物种中均参与花序发育和分化过程的调控，其功能在被子植物中相对保守。
为了深入探究钩藤钩的发生及形态建成调控机制，课题组基于前期从钩和花序不同发育时期转录组数据中筛选得到的3个SEP-like基因，通过RT-PCR和RACE技术克隆其完整编码区序列，并通过生物信息学、亚细胞定位、转录激活活性实验进行了初步的功能分析，进一步采用实时荧光定量（RT-qPCR）方法比较分析SEP-like基因在不同组织中的表达情况，以及在钩和花序发育过程中的表达模式，为揭示钩器官的起源，解析钩藤药用部位形态建成的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
生长4年的钩藤植株种植于贵州中医药大学国家基本药物所需中药材种子种苗繁育基地的种质资源圃中，为贵州省剑河县钩藤种植基地移栽而来，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为钩藤（Uncaria rhynchophylla）。实验材料来源于同一植株并于4—5月进行采集，根挖取后清洗并切段，带钩茎枝（钩茎）采集后立即在实验室进行茎、叶、钩芽、钩的分离，其中钩芽从钩茎茎尖以下第一节处切取，茎、叶、未木质化的钩从钩茎第三节分离获得。采集处于开花期的开花茎枝（花茎），随后在实验室分离头状花序不同发育时期材料，包括花序芽、幼花序和小花序，花序芽和幼花序从花茎茎尖以下第一节和第三节处切取，小花序为幼花序继续生长2周后从花序梗上切下的未开放头状花序。所有材料获得后立即投入液氮中速冻，随后放置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取和cDNA合成
总RNA提取方法参照天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带的完整性，采用微量分光光度计Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000检测其纯度和浓度，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的MightyScript 第一链cDNA合成Master Mix（去gDNA）说明书操作步骤，反转录得到cDNA产物后保存于-20 ℃低温冰箱。
1.2.2 钩藤SEP-like基因克隆
根据课题组前期获得的钩藤转录组数据（NCBI登录号：PRJNA1226735）中3个注释为SEP-like基因的编码区序列（表1），通过Premier 5.0 软件分别设计基因特异性引物（表2），以钩藤头状花序cDNA作为模板，参照北京康润诚业生物科技有限公司高保真DNA聚合酶SuperNova PCR Mix说明书对SEP-like基因的编码区进行RT-PCR扩增。扩增产物经电泳检测并切胶回收目的片段，连接pTOPO II载体（北京康润诚业生物科技有限公司）后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆并委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。根据测序结果设计5′ RACE和3′ RACE引物，以头状花序cDNA作为模板，使用北京天恩泽基因科技有限公司生产的5′ RACE Kit和3′ RACE Kit进行SEP-like基因编码区侧翼序列的扩增，扩增产物经电泳检测并切胶回收目的片段，同样经连接、转化和测序，以上测序结果经DNAMAN软件进行拼接得到基因的cDNA序列，并根据拼接结果分别设计基因cDNA序列两端引物（表2），经RT-PCR的扩增、连接、转化和测序，使用NCBI网站ORF Finder在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）验证SEP-like基因编码区的一致性。
表
1
钩藤转录组测序数据库SEP-like基因信息
Table
1
Information of the SEP-like genes based on the transcriptomes sequencing database of Uncaria rhynchophylla
1.2.3 生物信息学分析
根据RACE扩增后得到的钩藤SEP-like基因编码区序列，在DNAMAN 软件中推导出氨基酸序列，并进行序列比对；利用NCBI-CDD网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在线工具预测钩藤SEP-like蛋白的保守结构域；利用MEME Suite网站（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）进行保守基序的在线预测与分析；利用ExPaSy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）进行蛋白的理化性质分析；利用TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignalP-4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）在线工具分别进行跨膜结构域和信号肽预测；利用WOLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）和Softberry ProtComp 9.0（http://www.softberry.com/berry.phtml）在线软件进行蛋白的亚细胞定位预测；利用SOPMA（https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODLE（https://swissmodel.expasy.org/）在线软件分别进行蛋白二级结构和三级结构预测；根据NCBI网站Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对结果，选择同源性较高的氨基酸序列在MEGA 11软件中进行多序列比对，采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育进化树。
1.2.4 亚细胞定位分析
将钩藤SEP-like基因编码区序列去除终止密码子，设计带Xba Ⅰ和BamH I酶切位点的引物序列（表2），通过PCR扩增、切胶回收及酶切连接的方法，插入至pCAMBIA1305-35S-GFP载体绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因之前的Xba Ⅰ和BamH I酶切位点之间。构建得到的GFP融合蛋白表达载体经测序验证后，按照产品说明书采用冻融法转化至农杆菌EHA105感受态细胞（江苏瑞楚生物科技有限公司）中，同时转化空载体作为阴性对照。筛选得到的阳性菌落扩大培养后采用烟草瞬时转化法（Mai et al., 2023），具体以OD600为0.8的注射液（10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 MES、150 μmol·L-1 Acetosyringone）注射到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片下表皮，培养48 h后撕取注射部位表皮并使用DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，4′,6-diamidino-2-phenylindole）染料（北京兰杰柯科技有限公司）进行细胞核染色，采用Olympus IX73荧光倒置显微镜观察并拍照记录。
1.2.5 转录激活活性分析
转录激活活性分析采用酵母单杂系统，参考高玮林等（2022）的方法，具体为设计带Nco Ⅰ和BamH I酶切位点的引物序列（表2），将3个SEP-like基因的完整编码区序列经PCR扩增、切胶回收以及酶切连接的方法，分别插入至pGBKT7载体Nco Ⅰ和BamH I酶切位点之间，构建好的重组载体转化至酵母AH109感受态细胞，同时转化空载体作为阴性对照。在色氨酸缺陷型（SD-W）培养基平板上生长并获得阳性克隆，随后在SD-W液体培养基中摇菌培养至OD600为1.0，菌液经无菌水梯度稀释10、100、1 000倍，每个稀释度取2 μL同时点滴于SD-W和加入了显色反应底物X-α-gal的色氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷型培养基（SD-WHA）平板上，30 ℃培养3~5 d后观察酵母生长状况并拍照。所用酵母感受态细胞、X-α-gal和缺陷培养基均购买自北京酷来搏科技有限公司。
1.2.6 钩藤SEP-like基因的表达模式分析
参考周浩等（2022）的研究，采用RT-qPCR方法进行钩藤基因的表达分析，分别设计SEP-like基因的RT-qPCR引物，并以钩藤GADPH作为内参基因（表2）。对根、茎、叶、钩芽、钩及头状花序不同发育时期的材料提取总RNA并检测其浓度，取2 μg RNA进行反转录获得cDNA产物，随后稀释10倍作为荧光定量qPCR的模板，采用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix染料（北京康润诚业生物科技有限公司），按照SYBR qPCR Mix 5 μL、ddH2O 3 μL、正反向引物各0.5 μL（10 μmol·L-1）、模板1 μL的反应体系，设置95 ℃ 2 min后95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环的反应程序，在Bio-rad CFX96 Touch上进行RT-qPCR检测。每个样本设置3次生物学重复，采用2-ΔΔCt法计算得到待测基因的相对表达量。
表
2
SEP-like基因克隆及表达分析的引物
Table
2
Primers for SEP-like genes cloning and expression analysis
注：下划线表示酶切位点。
Note: Underline indicates restriction enzyme cutting site.
1.2.7 数据和图片处理
使用IBM SPSS Statistics 26 和Graph Pad Prism 9 软件进行数据的显著性分析及绘制柱状图，使用Photoshop CS6软件进行图片制作。
2 结果与分析
2.1 钩藤SEP-like基因的克隆
基于课题组前期获得的钩藤钩和花序发育不同时期转录组数据（PRJNA1226735），从Unigene的注释信息中检索到3个SEP-like基因（UrSEP），其中包含1个SEP1-like和2个SEP3-like基因。以钩藤头状花序cDNA作为模板，根据转录组测序获得的编码区序列信息设计基因特异性引物，RT-PCR扩增和测序后得到SEP1-like基因CDS（coding sequence）长度为738 bp，命名为UrSEP1，2个SEP3-like基因CDS长度分别为726 bp和729 bp，分别命名为UrSEP3.1和UrSEP3.2，各CDS扩增条带大小如图1所示。为检验所得CDS的完整性，采用RACE技术对基因编码区5′和3′端的侧翼序列扩增，所得序列拼接后使用两端引物再次对cDNA扩增验证（图1）和测序，得到UrSEP1、UrSEP3.1、UrSEP3.2的全长cDNA长度分别为931、981、1 097 bp。NCBI网站ORF Finder在线工具对cDNA序列进行分析，获得的编码区序列和长度与转录组测序结果基本一致。RACE扩增所得cDNA及完整编码区序列结果提交至NCBI的GenBank数据库，UrSEP1、UrSEP3.1、UrSEP3.2的序列号分别为PP558209、PP558210、PP558211。
图
1
UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2的扩增产物
Fig.
1
Amplification products of UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2
2.2 钩藤SEP-like蛋白的序列分析
根据RACE扩增后所得SEP-like基因的编码区序列，使用DNAMAN软件推导获得氨基酸序列并进行比对，其中UrSEP1编码245个氨基酸，UrSEP3.1和UrSEP3.2分别编码241和242个氨基酸，3个蛋白序列相似性为82.26%，UrSEP3.1和UrSEP3.2之间的相似性最高，达93.78%。利用ExPaSy-ProtParam在线分析UrSEP1、UrSEP3.1及UrSEP3.2蛋白的理化性质，其分子式分别为C122 0H1942N346O381 S10、C1198 H1935 N353 O368 S9、C1212H1942N354O372 S10；相对分子质量分别为27.87、27.46、27.75 kDa；理论等电点（pI）均大于7，分别为7.63、8.97、8.60，属于碱性蛋白；脂肪族系数分别为81.63、84.65、81.07；不稳定系数均超过40，分别为46.27、44.00、42.56，属于较不稳定蛋白；平均亲水性指数（GRAVY）均为负值，为-0.665、-0.679、-0.677，属于亲水性蛋白。利用NCBI-CDD在线网站搜索蛋白的保守结构域，发现3个蛋白均包含MADS和K-box结构域（图2），证明它们均属于MIKC型MADS-box转录因子家族。WOLF PSORT和Softberry在线预测蛋白的亚细胞定位，显示其均定位于细胞核中，符合转录因子在细胞中的定位特性。利用Signal IP和TMHMM网站预测表明UrSEP1、UrSEP3.1以及UrSEP3.2中均不存在信号肽和跨膜结构域。
图
2
UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2蛋白序列的保守结构域预测
Fig.
2
Prediction of conserved domains in UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2 protein sequences
2.3 钩藤SEP-like蛋白的结构预测
利用SOPMA在线软件进行的二级结构预测发现，钩藤SEP-like蛋白均由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链组成，其中α-螺旋和无规则卷曲的比例最高（图3：A），α-螺旋在UrSEP1、UrSEP3.1、UrSEP3.2中分别占53.88%、55.60%、55.79%，无规则卷曲分别占32.65%、31.12%、29.75%。因为3个蛋白序列同源性较高，所以SWISS-MODEL预测的三级结构均以同一模板建立（SMTL ID: 4ox0.2.C），结果（图3：B）显示钩藤SEP-like蛋白单体能够形成同源四聚体，这与氨基酸序列理化性质分析中单一蛋白均不稳定的结果对应，也与SEP蛋白以多聚体形式发挥作用的研究报道（Hugouvieux et al., 2024）一致。
图
3
UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2蛋白的二级和三级结构预测
Fig.
3
Secondary and tertiary structure predictions of UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2 proteins
2.4 钩藤SEP-like蛋白多序列比对和系统发育进化分析
NCBI网站中的Blast分析显示，钩藤SEP-like氨基酸序列与同科植物小粒咖啡（Coffea arabica）SEP相似性最高。对UrSEP1、UrSEP3.1、UrSEP3.2、小粒咖啡的CaSEP1/2和CaSEP3以及拟南芥的AtSEP1、AtSEP2、AtSEP3和AtSEP4进行多序列比对。根据已有研究报道可知，SEP-like蛋白的C末端包含特征性的SEP Ⅰ 和SEP Ⅱ 基序（motif）（Zhang et al., 2021; Dreni et al., 2022）。钩藤SEP-like中除了包含保守的MADS和K-box结构域外，SEP Ⅰ和SEP Ⅱ motif同样出现在蛋白的C末端（图4）。利用MEME网站的Motif在线预测和分析工具在钩藤、小粒咖啡及拟南芥的SEP序列中共找到7个氨基酸数量为15~50之间的保守基序，其中C末端的Motif 4和Motif 5在9个序列中均存在，分别对应SEP Ⅰ 和SEP Ⅱ 基序（图5）。根据Blast结果，选取来自小粒咖啡、番茄、烟草、芝麻、丹参、澳洲枸杞、辣椒、拟南芥等12个物种中的19条SEP蛋白序列构建系统发育进化树，结果（图6）显示UrSEP1与小粒咖啡CaSEP1/2亲缘关系最近，并且与拟南芥AtSEP1和AtSEP2同属于SEP1/2分支，UrSEP3.1和UrSEP3.2与CaSEP3同属于SEP3亚类。
图
4
钩藤SEP-like蛋白与小粒咖啡和拟南芥同源SEP多序列比对
Fig.
4
Multiple sequence alignment of SEP-like proteins in Uncaria rhynchophylla with homologous SEP in Coffea arabica and Arabidopsis thaliana
图
5
钩藤SEP-like 蛋白基序分析
Fig.
5
Motif analysis of Uncaria rhynchophylla SEP-like proteins
图
6
钩藤SEP-like蛋白的系统发育进化树分析
Fig.
6
Phylogenetic tree analysis of Uncaria rhynchophylla SEP-like proteins
2.5 钩藤SEP-like蛋白的亚细胞定位分析
分别构建35S启动子驱动的UrSEP1-GFP、UrSEP3.1-GFP、UrSEP3.2-GFP绿色荧光蛋白融合表达载体，采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法分析蛋白的亚细胞定位。观察发现融合蛋白的绿色荧光均集中分布于细胞核中，并且与细胞核标记染料DAPI的蓝色荧光位置基本重合（图7），表明3个蛋白均定位于细胞核中，与WOLF PSORT和Softberry在线预测的结果（表3）一致。
图
7
UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2蛋白的亚细胞定位
Fig.
7
Subcellular localization of UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2 proteins
表
3
钩藤SEP-like蛋白亚细胞定位预测
Table
3
Subcellular localization prediction of Uncaria rhynchophylla SEP-like proteins
2.6 钩藤SEP-like蛋白的转录激活活性分析
采用酵母单杂交检测系统对钩藤SEP-like蛋白的转录激活活性进行分析，结果如图8所示：将pGBKT7-UrSEP1、pGBKT7-UrSEP3.1、pGBKT7-UrSEP3.2重组载体和空载体阴性对照（pGBKT7）分别转化至酵母中，转化子均能在色氨酸缺陷型培养基（SD-W）平板上正常长出白色菌落；在加入了酵母半乳糖苷酶（MEL1）显色底物X-α-gal的色氨酸、腺嘌呤和组氨酸缺陷型培养基（SD-WHA）平板上，UrSEP1和UrSEP3.2在酵母中的表达能使菌落正常生长并显蓝色，而转化pGBKT7-UrSEP3.1的酵母细胞和空载体阴性对照均不能生长。以上结果表明，UrSEP1和UrSEP3.2具有转录激活活性，能够激活酵母单杂交系统报告基因HIS3、ADE2和MEL1的表达，而UrSEP3.1无此活性。
图
8
UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2在酵母细胞中的转录激活活性
Fig.
8
Transcriptional activation activity of UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2 in yeast cells
2.7 钩藤SEP-like基因的表达分析
采用RT-qPCR对钩藤SEP-like基因在不同组织，以及钩和花序不同发育时期的表达情况进行分析。钩芽和钩分别代表钩发育的早期和形成期（图9：A）。花序芽、幼花序和小花序为花序发育的3个不同时期，花序芽和幼花序分别为花序发育早期和头状花序形成初期（图9：B），小花序为头状花序形成中期，此时花序上的小花已基本形成（图9：C）。结果（图9：D-F）显示，3个SEP-like基因在花序芽、幼花序和小花序中的表达水平均高于根、茎和叶，与SEP基因在植物生殖生长中发挥关键作用的报道（Dreni et al., 2022）一致。UrSEP1在根和叶中的表达水平类似且均大于茎，在钩芽中的表达量显著高于茎和叶，而在钩中下降至极低水平，花芽中UrSEP1的表达水平虽然低于钩芽，但随着头状花序形成而升高（图9：D），其表达模式与钩发育过程中相反。UrSEP3.1在根、茎、叶中的表达水平次序为根> 叶> 茎，在茎中表达水平极低；在钩芽中的表达量和叶相近，在钩中显著升高至钩芽的14.9倍；其表达水平在花序发育中随着花序形成而上升，与钩发育中的表达模式类似（图9：E）。UrSEP3.2在茎中几乎不表达，在根中的表达水平大于叶；钩芽中该基因的表达量上升而在钩中略有下降；同样在花序发育过程中，UrSEP3.2的表达量在花芽中最高并随着头状花序形成逐渐降低（图9：F）。以上结果说明，UrSEPs参与了钩的发育过程，而且2个UrSEP3基因在钩和花序发育过程中具有类似的表达模式，表明钩与花序之间的相似性，而UrSEP1在两种发育过程中的表达模式差异提示其可能参与调控钩与花序发育命运的分歧。
图
9
UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2 在钩藤中的表达模式分析
Fig.
9
Analysis of UrSEP1, UrSEP3.1 and UrSEP3.2 of expression patterns in Uncaria rhynchophylla
3 讨论与结论
钩藤的钩含有多种生物碱和三萜类化合物，其在茎上的着生数量是重要的形态特征和生长指标之一（邓小红等，2020；Liu et al., 2024），因此钩器官发生和形态建成研究对钩藤品种改良以及未来精准育种具有重要意义。Wan等（2023）在对钩藤单钩发育的转录组分析中发现，形成单钩的一侧腋芽中有4个花器官发育相关的基因表达，其中包括1个MADS-box基因AGAMOUS(AG)，从分子层面证明钩与花序的同源性，但并未就这些基因开展进一步的研究。MADS-box蛋白通过控制下游复杂的基因调控网络从而控制被子植物花和花序的发育过程（Wils & Kaufmann, 2017）。课题组前期分别对钩和花序发育过程开展了转录组测序，并检索到3个同属于MADS-box的 SEP-like 基因，它们在两种发育过程中均有表达，提示这些花器官发育相关基因可能同样参与了钩的发育调控。本研究克隆了钩藤钩发育相关的SEP-like基因UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2，通过生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活分析及基因表达模式分析说明SEP-like基因在结构与功能上的保守性和分化，其可能在钩与花序发育命运的分歧中发挥作用。
SEP转录因子是植物成花转变以及花、花序、果实发育中的关键蛋白。目前，SEP的2个亚家族SEP3/AGL9和LOFSEP及后者包含的3个亚类（SEP1/2、FBP9/23、SEP4）在大多数被子植物中均发现了对应的编码基因，然而在十字花科（如拟南芥）、金鱼草（Antirrhinum majus）、油橄榄（Olea europaea）及咖啡（Coffea arabica）等植物中缺少FBP9/23基因（Dreni & Ferrándiz, 2022）。作为与钩藤同属于茜草科的咖啡，其基因组中虽然包含了SEP3基因CaSEP3、SEP1/2基因CaSEP1/2、以及SEP4基因CaSEP4，但在花发育过程中并未检测到CaSEP4表达（de Oliveira et al., 2014）。这与课题组前期对钩藤花序发育过程进行的转录组测序结果类似，仅发现了SEP3和SEP1/2两类基因表达，而且只有1个SEP1/2基因UrSEP1，这与咖啡中的结果一致。钩藤SEP3亚类中包含了2个基因UrSEP3.1和UrSEP3.2，这可能与钩藤具有更为复杂的头状花序结构和开花控制有关，其侧枝上的腋芽能够分化为弯钩或者花序。SEP蛋白包含MADS结构域（M）和K结构域，介于M和K之间的间隔区（I）及C末端（C），其中MADS结构域能够使蛋白发生二聚化，并识别DNA上的CArG序列；K结构域使SEP自身或与其他MADS-box蛋白形成更为复杂的四聚体并结合DNA，其中亮氨酸拉链基序是形成四聚体的核心区域；C末端是SEP蛋白最为多样化的区域，同样能够介导其与MADS-box蛋白的相互作用形成复合物，C末端通常具有SEP Ⅰ 和SEP Ⅱ 2个保守基序（Shi et al., 2015; Theissen et al., 2016; Rumpler et al., 2018）。保守结构域分析、多序列比对和蛋白基序分析显示，UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2的M和K结构域与拟南芥同源蛋白相比均高度保守，这与其在蛋白结构预测中均能够形成四聚体及细胞核定位的结果一致，而且3个蛋白的C末端均具有SEP Ⅰ 和SEP Ⅱ 基序，表明钩藤SEP-like在形成蛋白复合物及DNA识别功能上的保守性，UrSEP1和UrSEP3.2具有转录激活活性，这与拟南芥AtSEP1和AtSEP3在酵母中能够转录自激活的结果（de Folter et al., 2005）一致。本研究发现，UrSEP3.1和UrSEP3.2虽然同属于SEP3亚类，但是UrSEP3.1无转录激活活性，系统进化树分析表明UrSEP3.1比UrSEP3.2与咖啡CaSEP3的亲缘关系更近，体现了二者的分化，2个钩藤SEP3蛋白在MIK结构域序列上虽然高度相似（97.69%），但是C末端相似度较低（84.06%），C末端序列差异可能造成二者转录激活活性不同。SEP蛋白通常形成高级复合物，而这种复合物的形成会对其结合DNA造成阻碍，C末端序列通常包含疏水和极性的氨基酸残基，能够增加疏水面从而精细调控蛋白对其他MADS-box蛋白及下游基因的结合，去除C末端的AtSEP3及竹叶花椒（Zanthoxylum armatum）SEP3-like蛋白的ZaMADS70截短体均丧失了转录激活活性（Malcomber & Kellogg, 2005; Immink et al., 2009; Tang et al., 2022）。从转录激活活性分析来看，UrSEP3.2与AtSEP3的功能更相近，而UrSEP3.1可能与其他蛋白相互作用从而来结合DNA。
本研究发现，UrSEP3.1和UrSEP3.2在钩中的表达水平能够分别达到茎的38.3倍和389.5倍，虽然UrSEP3基因在钩芽中的表达量显著低于花序芽，但是在钩和花序的发育过程中表现出相似的表达模式。这与葡萄科和西番莲科植物卷须的研究结果一致，这两种卷须被认为来源于花序变态，在葡萄（Vitis vinifera）和西番莲（Passiflora edulis）卷须中均发现了花及花序分生组织特异基因的表达，特别是西番莲SEP3-like基因在卷须原基和花分生组织中均检测到了转录，而在侧枝的分生组织中无表达（Sousa-Baena et al., 2018）。因此，本研究进一步证明了钩藤中钩器官与花序的同源性，并且UrSEPs基因在钩和花序两种发育过程中的表达差异提示二者发育命运的分歧发生于早期阶段。花和花序发育需要SEP基因精确的时空表达，拟南芥SEP基因的表达在花分生组织（floral meristem，FM）分化前期受到抑制，以维持分生组织的生长，而在FM分化阶段SEP大量转录从而启动花器官的分化（Wils &Kaufmann, 2017）。头状花序发育过程中SEP基因的表达情况更为复杂，非洲菊（Gerbera hybrida）SEP1/2/4-like基因在未分化的花序分生组织（inflorescence meristem，IM）中表达并快速增长，在IM分化出现小花原基时达到顶峰，SEP3-like基因在小花原基分化时大量表达（Zhang T et al., 2017）；金盏菊（Tagetes erecta）TeSEP3-1、TeSEP3-3和TeSEP4在小花原基出现时大量表达，TeSEP3-2在花器官分化时表达上升，而TeSEP1在花芽生长中则呈现先上升后下降再上升的趋势（Zhang et al., 2021）；二球悬铃木（Platanus acerifolia）PlacSEP3.2在花序开始分化时表达并在其发育过程中具有较高的表达量，PlacSEP3.1与PlacSEP3.2类似但表达量较低，PlacSEP1.3同样在花序初始期表达，但表达量升高的时期晚于PlacSEP3.1，PlacSEP1.1在后期花和果的发育过程中表达，而PlacSEP1.2在雌花序中表达（Zhang S et al., 2017）。本研究发现，在钩发育过程中UrSEP1的表达量峰值出现在早期，并在钩形成期降至低谷，而花序发育过程中该基因在头状花序形成初期才出现峰值并维持至中期，表达模式的差异可能影响了IM和FM的分化。此外，SEP的作用具有剂量效应，体外实验报道了拟南芥SEP蛋白的丰度能够影响其与DNA及其他蛋白的结合，棉花GhSEPs较低的表达水平即能够诱导转基因拟南芥开花，但作用于花发育则需要较高的表达量（Jetha et al., 2014; Rumpler et al., 2018; Chen et al., 2022）。本研究中，UrSEPs在钩发育过程中的总体表达水平低于花序发育过程，推测低丰度的UrSEPs可能不足以引发花序的分化，从而造成钩与花序在发育早期发生分歧。
本研究克隆了钩藤钩器官发育相关的SEP-like基因，并进行了生物信息学、亚细胞定位、转录激活活性和表达分析。UrSEP1、UrSEP3.1和UrSEP3.2在钩藤不同组织中的表达特性，以及在钩和花序发育过程中的表达模式表明其参与了钩的发育过程，并进一步证明钩与花序的同源性，二者在发育的早期阶段即发生分歧，UrSEPs基因可能在这一过程中发挥作用。本研究从基因层面为钩器官的来源提供了线索，但SEP-like基因在钩发育中的功能还需要进一步的分析，如通过原位杂交技术、转基因技术、酵母双杂交和染色质免疫沉淀测序等方法比较UrSEPs基因在钩和花序发育各阶段的表达定位差异，解析相互作用蛋白及下游基因调控网络，从而深入研究钩器官的形态发生机制。