摘要
花椒（Zanthoxylum bungeanum）和竹叶花椒（Z. armatum）均是重要的木本油料和香料树种，在我国栽培范围广、种植面积大。为明确这2种花椒属植物叶绿体基因组特征，基于现已公布的序列信息，利用生物信息学方法分析叶绿体基因组结构、基因功能、序列特点及其密码子使用偏好性，并通过比较基因组学解析序列变异情况，筛选高变区构建系统发育树。结果表明：（1）2种花椒属植物叶绿体基因组结构具有较高的一致性，各类编码基因数目基本相同，基因功能类别相似。（2）在花椒和竹叶花椒叶绿体基因组序列中检测出多个分散重复和串联重复，并分别筛选出95个和98个 SSRs 位点，并且约79%都是以A/T为基序的单核苷酸重复。（3）花椒和竹叶花椒叶绿体基因组密码子GCall含量均小于40%、有效密码子数（ENC）均值为48.5%，表明其密码子整体偏好使用A/T碱基，偏好性较弱且受自然选择的影响较大；筛选出的11个最优密码子均是以A/U结尾，其中UAU是两者共有最优密码子。（4）以花椒叶绿体基因组作为参照，在竹叶花椒叶绿体基因组编码区共检测到130个SNP，其中ycf1基因有24个SNP变异位点，占总变异位点的18.5%；同时，在8个编码基因内含子区共检测到14个indel位点；以Pi>0.010为标准筛选出3个高变区，分别为rpoB-trnC-GCA-1、trnH-GUG-psbA和ycf1，其中基因间隔区rpoB-trnC-GCA-petN的变异程度最高。（5）基于高变区序列构建的系统发育树以95%以上的支持率将花椒属下的6个种及品种进行了准确归类划分。花椒主要栽培种叶绿体基因组的结构、数目和功能相似性较高，重复序列与SSR位点丰富，其密码子具有较明显的A/T偏好性；序列高变区集中分布在少数编码基因上和几个特定基因间隔区内，并且在花椒属内具有较高特异性。该研究为花椒栽培种的分子标记开发、资源分类鉴定及其遗传演化机制研究提供了理论依据。
Abstract
Zanthoxylum bungeanum and Z. armatum are significant woody oil and spice tree species, which have a wide cultivation range and large planting area in China. To elucidate the characteristics of their chloroplast genomes, we employed bioinformatics methods on publicly available sequences to analyze chloroplast genome structure, gene function, sequence features, and codon usage bias. Comparative genomics was used to identify sequence variations and screen hypervariable regions for phylogenetic tree construction. The results were as follows: (1) The chloroplast genome structures of the two species of Zanthoxylum had high consistency, the numbers of coding genes were basically the same, and the gene function category was similar. (2) Multiple scattered repeats and tandem repeats were detected in chloroplast genome sequences of Z. bungeanum and Z. armatum, and 95 and 98 SSRs sites were selected, respectively, about 79% of SSRs were single nucleotide repeats with A/T motif. (3) The chloroplast genome codon GCall contents of Z. bungeanum and Z. armatum were less than 40%, and the average ENC (effective number of codon) was 48.5%, indicating that the codon preferred to use A/T base, the bias was weak, and both were more affected by natural selection. All the 11 selected optimal codons ended in A/U, among which UAU was the common optimal codon. (4) Using chloroplast genome of Z. bungeanum as the reference, a total of 130 SNP were detected in the coding region of chloroplast genome of Z. armatum. Among them, 24 SNP of ycf1 gene accounted for 18.5% of the total variation sites. At the same time, a total of 14 indel sites were detected in the intron region of 8 coding genes. Three highly variable regions were selected with Pi>0.010 as the standard, namely rpoB-trnC-GCA-petN, trnH-GUG-psbA and ycf1. Among them, the gene spacer region rpoB-trnC-GCA-petN had the highest degree of variation. (5) The phylogenetic tree constructed based on hypervariable regions accurately classified six species and cultivars within the genus Zanthoxylum with a strong bootstrap support (>95%). The chloroplast genomes of major cultivated Zanthoxylum species exhibit high similarity in structure, number and function, while containing abundant repetitive sequences and SSR loci, and their codons have a relatively obvious A/T bias. Notably, sequence hypervariable regions are predominantly distributed within a few coding genes and intergenic spacers, and have high specificity within the genus. This study provides a theoretical foundation for molecular marker development, germplasm identification, and investigations into the genetic evolutionary mechanisms of cultivated Zanthoxylum species.
花椒属（Zanthoxylum）内多数植物的叶、果实有椒麻味，不仅是重要的调味品，还是我国传统中药材（曾京京，2000）。花椒属植物种类繁多，全球约有250种，我国现有39种14个变种（黄勤琴，2023），但目前生产上大面积推广种植的仅有花椒和竹叶花椒2种。花椒分布广泛，在我国西北、华北及西南地区均有分布，而竹叶花椒则主要分布于长江流域及以南区域，尤其是四川、重庆、云南、贵州等地。
叶绿体基因组为植物所特有，相比核基因组具有四分体结构保守且完整，以及进化速率适中、全长序列短、方便测序分析、检测成本低等优势（王飞等，2023），现已应用于植物分子标记开发（李思巧等，2019）、亲缘关系鉴定（刘霞等，2023）、群体遗传变异分析（侯娜，2019）及进化规律研究（Henriquez et al., 2020）等方面。近年来，高通量测序技术快速发展，测序成本降低，花椒属内多个物种的全长叶绿体基因组相继发表，这为研究该属植物的遗传变异规律、标记开发与物种鉴定、系统发育关系提供了新思路。候娜（2019）测序分析了7个不同花椒群体的叶绿体基因组，发现群体间存在较大遗传变异，检测出了大量SSR序列，但群体家系内的个体间基本未出现遗传分化；李思巧等（2019）从花椒叶绿体基因组中筛选到10对高多态性cpSSR标记用于花椒属物种鉴定和遗传多样性分析；黄勤琴（2023）基于40个花椒属物种叶绿体基因组构建了该属较完整的系统进化树，分支显示飞龙掌血属（Toddalia）和花椒属的物种存在嵌套关系，花椒属下分的2个亚属间的物种聚类也较为混乱，说明分子层面并不支持花椒亚属的划分；而祖先分布区重建结果将我国花椒属2大分支分离的原因归结于青藏高原的隆起、第四纪冰川作用和人类活动，这导致花椒在我国由西向东扩散，与起源种地理隔离并形成独立种。遗传信息传递、基因表达及蛋白质功能发挥离不开编码氨基酸的遗传密码子，密码子的准确识别是提高基因表达的关键（Wei et al., 2014）。在自然选择下，植物叶绿体基因组密码子均存在使用偏好性，并且不同物种或基因组的密码子使用频率不同，这为研究植物起源及遗传进化提供了新思路（郭佳星等，2023；代国娜等，2024）。刘霞等（2023）分析了九叶青花椒叶绿体基因组的密码子偏好性，发现密码子第三位碱基有较强的A/T碱基偏好性。
近年来，随着高通量测序技术的迅速发展，花椒属植物叶绿体基因组相继公布，这为进一步探究物种间序列变异情况及其遗传进化规律奠定了基础。目前，花椒主要栽培种叶绿体基因组特征及密码子偏好性鲜见报道，其序列变异情况还不清楚；同时，花椒属现有分子标记多是基于某个基因片段开发出来，这样的分子标记多表现为特异性差、识别度不高。本研究以花椒属主要栽培种花椒和竹叶花椒的全长叶绿体基因组序列为研究对象，依托比较基因组学的基本原理，利用多种生物信息学分析方法和软件，分析其叶绿体基因组特征和密码子使用偏好性，通过全长基因组序列比对检测特异性位点及高变区，并基于筛选出来的高变区序列构建系统发育树，拟探讨以下问题：（1）花椒主要栽培种叶绿体基因组的结构特征及其在基因数目和功能类别上的差异；（2）重复序列与SSR位点；（3）密码子使用偏好性；（4）序列变异情况及特异性位点与高变区；（5）基于高变区序列构建的花椒主要栽培种系统发育关系。
1 材料与方法
1.1 材料及序列获取
基于NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中现已发布的花椒属植物叶绿体基因组，根据物种拉丁名进行检索，获取花椒和竹叶花椒全长叶绿体基因组序列，GenBank登录号分别为MW206786.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW206786.1)、MN017131.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ MN017131.1)。
1.2 试验方法
1.2.1 叶绿体基因组结构特征及可视化处理
利用Geneious 8.1.3（Kearse et al., 2012）计算叶绿体基因组大小、编码基因数及GC含量，做四分体结构区划，并统计相关信息；采用OGDRAW（https://chlorobox. mpimpgolm. mpg. de/OGDraw.html）绘制叶绿体基因组环形图谱。
1.2.2 重复序列与SSR检测
重复序列及SSR分析：分别使用在线工具REPuter（https://bibiserv. cebitec.unibielefeld.de/reputer）和Tandem Repeats Finder（https://tandem. bu.edu/trf/trf.html）对花椒叶绿体基因组中的散在重复和串联重复进行准确预测；利用MISA软件（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）检测花椒属植物叶绿体基因组中的SSR位点，单核苷酸至六核苷酸重复参数分别设置为10、5、4、3、3、3。
1.2.3 密码子偏好性分析
以序列不重复、碱基组成正确、起始及终止密码子（termination codon，TER）正确、长度大于300 bp为条件筛选编码蛋白质编码序列（coding sequence，CDS），基于筛选标准，分别从花椒和竹叶花椒叶绿体基因组中筛选出48条符合条件且两者共有的CDS用于密码子偏好性分析。利用 CodonW（郭佳星等，2023）分析CDS的有效密码子数（effective number of codon，ENC）和相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU），统计密码子组成，分析使用偏好性，并筛选最优密码子。
1.2.4 序列变异情况及核苷酸多态性分析
用MAFFT v.7（https://mafft.cbrc.jp/align-ment/server/）及 Geneious 8.1.3 软件对比分析2种花椒属植物叶绿体基因组编码基因序列变异，统计分析Indel位点、SNP位点及其突变类型。利用DnaSP 6软件（Rozas et al., 2017）分析花椒和竹叶花椒叶绿体基因组的核苷酸多样性（Pi），滑动窗口长度设为600 bp，步长设为200 bp，进行序列高变区筛选。
1.2.5 系统发育分析
为验证所发掘的特异性基因片段（高变区）能否对花椒主要栽培种进行准确分类鉴定，从NCBI数据库中下载了6个花椒主要栽培种及4种花椒属植物的叶绿体基因组序列，以飞龙掌血（Toddalia asiatica）为外类群，多序列比对后，剪切各自对应的高变区序列，通过RAxML 8.2.12软件（Stamatakis，2014）下的HPC2 on XSEDE模型，利用最大似然法（maximum likelihood, ML）构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 叶绿体基因组结构特征
花椒和竹叶花椒的全长叶绿体基因组信息见表1。从叶绿体基因组总长度来看，竹叶花椒叶绿体基因组的总长仅比花椒多出178 bp；从编码基因数来看，竹叶花椒比花椒少1条CDS，而rRNA和tRNA数量相同，分别为8个和37个；两者的叶绿体基因组GC含量也相同，为38.5%。花椒和竹叶花椒叶绿体基因组环形图谱见图1。
表
1
花椒和竹叶花椒叶绿体基因组基本信息
Table
1
Basic information of Zanthoxylum bungeanum and Z. armatum chloroplast genomeas
图
1
花椒属叶绿体基因组环形图谱
Fig.
1
Chloroplast genome ring map of Zanthoxylum
花椒属植物叶绿体基因组编码基因主要由自我复制相关基因、光合作用相关基因、其他基因和ycf类基因组成（表2）。在2种花椒属植物叶绿体基因组中发现了18个含有2个及以上外显子的基因，其中含有2个外显子的基因有15个，含有3个外显子的基因有3个；叶绿体基因组共有18个基因具有2个拷贝，其中rps19和ycf1基因在花椒叶绿体基因组中为双拷贝，但在竹叶花椒中均变成了单拷贝。值得注意的是，rps12基因在花椒叶绿体基因组中含有3个外显子，而在竹叶花椒叶绿体基因组中只含有2个外显子。另外，在竹叶花椒叶绿体基因组中找到了2个特有的蛋白质编码基因infA和psbC，而rpl22基因因缺失2个位点共162个碱基导致在竹叶花椒叶绿体基因组未能注释成功，因此该基因为花椒叶绿体基因组特有。
表
2
花椒和竹叶花椒叶绿体基因组基因类型
Table
2
Chloroplast genome genotypes of Zanthoxylum bungeanum and Z. armatum
注：2表示该基因存在2个拷贝；(2)表示该基因有2个外显子，(3)表示该基因有3个外显子；*表示该基因为特有基因或在2个物种间存在较大差异。
Note: The gene labeled with superscript 2 has 2 copies; the gene labeled(2) has 2 exons, and the gene labeled(3) has 3 exons.* indicates that the gene is endemic or differs significantly between the two species.
2.2 重复序列与SSR分析
通过全长叶绿体基因组序列检测，分别从花椒和竹叶花椒中检测出48个分散重复序列，其中花椒叶绿体基因组中有3个互补重复、17个正向重复、21个回文重复和7个反向重复；竹叶花椒中有1个互补重复、20个正向重复、19个回文重复和8个反向重复。从重复序列类型来看，花椒叶绿体基因组中回文重复类型最为丰富，约占重复序列总数的43.7%；而竹叶花椒则是正向重复最为丰富，占41.7%。同时，对花椒和竹叶花椒叶绿体基因组中的串联重复序列进行了检测，分别有18个和19个，并且大多数分布在大单拷贝区（large single copy region，LSC）和反向重复区（inverted repeat region，IR）（图2：A）。
在花椒叶绿体基因组中共筛选出95个SSRs位点，其中单核苷酸重复75个（A/T重复基序73个，C/G重复基序2个），二核苷酸重复5个（均是AT/AT重复基序），三核苷酸重复8个（AAG/CTT重复基序3个，AAT/ATT重复基序5个），四核苷酸重复7个（AAAC/GTTT、AACT/AGTT、ACAT/ATGT和AGAT/ATCT重复基序各1个，AAAT/ATTT重复基序3个），未检测到五核苷酸及以上重复类型；在竹叶花椒叶绿体基因组中筛选出98个 SSRs 位点，相比花椒多出2个A/T基序的单核苷酸重复和1个AT/AT基序的二核苷酸重复，同样未发现五核苷酸及以上重复类型（图2：B）。这说明2种花椒属植物SSR类型中以A/T基序的单核苷酸重复最为丰富。
图
2
基因组序列重复结构与SSR类型
Fig.
2
Repeat structure and SSR type of genome sequence
2.3 密码子使用偏好性分析
2.3.1 密码子组成分析
花椒和竹叶花椒叶绿体基因组密码子第1至第3位上的GC含量均存在较大差异，分布规律呈现GC1>GC2>GC3，其中GC1含量最高（45%以上），GC3含量最低（仅约占31%），并且从密码子第3位碱基组成来看，T3s和A3s占比均在40%以上，说明其密码子偏好G/C碱基开头，A/T碱基结尾；2种花椒属植物密码子GCall分别为38.79%和38.95%，ENC值分别为48.74和48.43，表明其密码子整体偏好使用A/T碱基且偏好性较弱。同时，密码子适应指数（codon adaptation index，CAI）和密码子偏性指数（codon bias index，CBI）均接近或小于0，说明其叶绿体基因表达水平较低（表3）。
表
3
花椒和竹叶花椒叶绿体基因组密码子相关参数
Table
3
Related parameters of chloroplast genome codon of Zanthoxylum bungeanum and Z. armatum
分别计算每条CDS密码子第1至第3位上的GC含量和ENC值，根据统计数据绘制热图（图3）。由图3可知，2种花椒属植物多数基因密码子GC1显著高于GC2和GC3，核糖体小/大亚基rps类和rpl类基因的GC2含量普遍高于其他基因类型；从各基因的ENC值实际取值范围来看，花椒和竹叶花椒分别为37.04~61.00和37.08~60.86，取值均大于35，这进一步表明其密码子偏好性较弱；2种花椒属植物各基因对应的ENC值相差小，基因cemA的差值最大仅为2.11，其次是rps2和rpl16基因，其差值分别为1.48和1.22，其余基因的差值均小于1，说明花椒和竹叶花椒的密码子偏好性差异不大。
图
3
花椒和竹叶花椒叶绿体编码基因密码子GC含量及ENC值
Fig.
3
GC contents and ENC values of Zanthoxylum bungeanum and Z. armatum chloroplast coding gene codons
2.3.2 密码子中性绘图分析
由图4可知，花椒和竹叶花椒线性回归系数分别为0.227 1和0.251 4，并且GC12和GC3相关性均很弱，说明自然选择是影响密码子使用偏好的主要原因。各基因显示点在图中分布范围集中，说明碱基突变对这2种花椒属植物密码子使用偏好影响小，2条线截距分别为0.367 8、0.361 9，表明碱基突变对2种花椒属植物密码子使用偏好的影响约为36%，而自然选择和其他因素对密码子使用偏好的影响则约为64%，进一步证明2种花椒属植物密码子使用偏好受自然选择的影响更大。
图
4
中性绘图分析
Fig.
4
Neutral plot analysis
2.3.3 最优密码子筛选
根据ENC值大小从两个极端分别选择5条CDS建立高低基因表达库，分别计算高低基因表达库中氨基酸对应的密码子RSCU值，并求ΔRSCU值。将RSCU>1（高频密码子）且ΔRSCU≥0.08（高表达密码子）的密码子确定为最优密码子，在花椒叶绿体基因组中筛选出6个最优密码子，分别为ACA、UAU、CUU、CGA、AAU、CAU，其中2个以A结尾，4个以U结尾；在竹叶花椒叶绿体基因组中筛选出5个最优密码子，分别为UUU、UCU、CGU、GUA、UAU，其中以U结尾的有4个，以A结尾的仅有1个；而花椒和竹叶花椒共有的最优密码子为UAU（图5）。这说明从2种花椒属植物中筛选出来的共10个最优密码子均以A/U结尾。
图
5
花椒和竹叶花椒叶绿体基因组最优密码子筛选
Fig.
5
Optimal codon selection of chloroplast genome from Zanthoxylum bungeanum and Z. armatum
2.4 基因组序列变异位点与核苷酸多态性分析
以花椒叶绿体基因组作为参照，统计分析竹叶花椒叶绿体基因组中蛋白质编码基因序列上的变异位点（表4）。SNP是基因组序列中的单核苷酸变异，主要突变类型有转换（Ts）和颠换（Tv），在竹叶花椒叶绿体基因组编码区共检测到130个SNP，其中包括48个Ts和82个 Tv，这两种SNP的突变类型比率为 1∶1.7。Ts突变类型中有31个C与T之间的碱基转换，其次是A与G之间的碱基转换，有17 个；Tv突变类型中以G与T之间的碱基颠换最为丰富，有37个，其次是A与C之间的碱基颠换，有25个。所有编码基因中matK、rps16、atpA、rpoC1、ndhF、ndhA和ycf1这7个基因的SNP变异位点均在6个及以上，尤其是ycf1基因共有24个SNP变异位点，占总变异位点的18.5%，说明其具有丰富的核苷酸多态性。同时，对存在于叶绿体基因组编码基因中的缺失（Del）与插入（Ins）位点进行了检测，在8个编码基因序列中共发现了5个插入位点和9个缺失位点。值得注意的是，所有的插入与缺失位点均分布在对应编码基因的内含子区域。其中，基因rps16插入与缺失位点最丰富，有3个位点；而基因rpoC1插入的碱基数则最多，插入位点序列为TTTTTT，碱基数为6 bp。
表
4
竹叶花椒叶绿体编码基因变异情况统计
Table
4
Statistics of Zanthoxylum armatum chloroplast coding gene variation
花椒、竹叶花椒叶绿体基因组的大单拷贝区（LSC）、反向重复区（IR）、小单拷贝区（SSC）的核苷酸变异分析结果（图6）表明，2种花椒属植物叶绿体基因组中核苷酸变异程度较高的区域集中在LSC和SSC区，而IR区的核酸变异普遍处于较低水平。以核苷酸多态性指数Pi>0.010为标准，检测到3个核酸高变区。其中，Pi值最高的区域在LSC 区28 414~29 725 bp之间，结合基因组图谱注释该高变区为rpoB-trnC-GCA-petN基因间隔区，在这3个基因的2个间隔区内共检测到40个变异位点；其次是注释为trnH-GUG-psbA基因间隔区（1~860 bp）和位于SSC区的ycf1基因（129 181~130 280 bp）。同时，通过统计核苷酸变异较丰富（Pi>0.005）的滑动窗口下的变异位点，发现约80%的变异位点都位于基因间隔区，这进一步说明花椒属植物叶绿体基因组变异多发生在非编码区。
图
6
竹叶花椒叶绿体基因序列核苷酸多态性
Fig.
6
Chloroplast gene sequence nucleotide polymorphisms of Zanthoxylum armatum
2.5 系统发育分析
基于叶绿体基因组高变区rpoB-trnC-GCA-petN构建花椒属植物系统发育树。结果如图7所示，系统发育树以95%以上的支持率将6种花椒属植物划分为两大类，石山花椒和异叶花椒聚为一类，花椒、川陕花椒、竹叶花椒和墨脱花椒聚为另一类；同时，发现川陕花椒和花椒在同一个小分支上，表明其亲缘关系较近，这一点从起源距离上也可说明。值得注意的是，基于该高变区构建的系统发育树以100%的支持率将3个花椒品种和3个竹叶花椒品种进行了准确归类，说明该高变区在花椒主要栽培种及品系间存在丰富且可靠的遗传变异位点，可用于花椒主要栽培种的分类鉴定。
图
7
基于叶绿体基因组的rpoB-trnC-GCA3-petN间隔区序列构建的系统发育树
Fig.
7
Phylogenetic tree based on rpoB-trnC-GCA3-petN spacer sequences of chloroplast genome
3 讨论与结论
植物叶绿体基因组结构完整、序列保守且可独立遗传，在研究植物分类鉴定和演化进程中优势明显（王飞等，2023）。近年来，随着高通量测序技术发展，花椒属内多个物种全长叶绿体基因组被组装、注释并公布，甚至是下分至品种，如‘大红袍’‘九叶青’等（刘霞等，2023）。本研究中，就叶绿体基本特征而言，花椒和竹叶花椒具有高度相似性，序列全长仅相差178 bp，CDS、rRNA和tRNA数目基本相同，GC含量均为38.5%，基因功能类别也相似，这表明同属植物叶绿体基因组具有母系遗传的保守性和同源性。本研究发现IR区边界处的rps19和ycf1基因在花椒叶绿体基因组中为双拷贝，但在竹叶花椒中却都变成了单拷贝，推测可能是发生了假基因化。同样，张晶晶等（2024）也发现16种忍冬属（Lonicera）囊管组植物叶绿体基因ycf1均出现了假基因化。该现象在叶绿体基因组中较为普遍，由单核苷酸突变或插入、缺失引发，常发生在四大分区边界处的基因编码区。本研究发现，rpl22因2个位点共缺失162个碱基而导致该基因在竹叶花椒叶绿体基因组中未能注释成功，这也是四分体边界区域基因的假基因化体现。同时，在竹叶花椒叶绿体基因组中发现了2个特有的编码基因infA和psbC，而Li等（2024）早期就在509份芸香科植物叶绿体基因组进化研究中观察到大量物种的infA基因丢失，这从侧面反映出花椒叶绿体基因组中的infA和psbC基因在该物种演化进程中丢失，这2个基因可作为研究花椒属植物自然演化的重要依据。植物叶绿体基因组中含有丰富的SSRs位点，基于叶绿体基因组开发出来的SSRs标记多态性丰富，信息含量高且受外界环境影响小（Lee et al., 2019）。本研究分别从花椒和竹叶花椒叶绿体基因组中筛选出95个和98个SSRs 位点，其中单核苷酸重复数目最多，均在75个以上且多数为A/T重复基序，单核苷酸重复约占总位点数的78.5%，相比忍冬属植物（熊瑶等，2024），从花椒属植物叶绿体基因组中检测到的SSR数量更多、多态性更为丰富；二核苷酸重复、三核苷酸重复和四核苷酸重复数目相当，无显著性差异；扁核木属和楠属植物叶绿体基因组中均存在一定数量的五核苷酸重复、六核苷酸重复（王飞，2022；戴前莉等，2024），但在这2种花椒属植物中并未检测到。本研究筛选出来的这些高效SSRs标记可用于花椒和竹叶花椒主要栽培品种的分类鉴定。
本研究表明，密码子第3位上受到的选择压力较小，故GC3可用作判别密码子偏好性。花椒和竹叶花椒叶绿体基因组中GC3的占比均显著小于GC1、GC2，说明花椒主要栽培种叶绿体基因组偏好使用A或T结尾的密码子；最优密码子具有高频且高表达的特性，其密码子偏好性也更强，从花椒和竹叶花椒中筛选出来的最优密码子均为NNA或NNT类型，这进一步印证了上述结果，在油茶（Camellia oleifera）（王鹏良等，2018）、樟树（Cinnamomum camphora）（秦政等，2018）的研究中发现密码子偏好A或U结尾。密码子使用偏好性受突变、自然选择、碱基组成等多因素影响。基于花椒和竹叶花椒密码子基本参数进行相关性及中性绘图分析，发现GC3和GC1、GC2、GC12之间相关性很弱，回归线斜率仅为36%，表明自然选择是影响密码子偏好性的主要因素。这与油茶（王鹏良等，2018）、樟树（秦政等，2018）、酸枣（Ziziphus jujuba）（胡晓艳等，2019）等的研究一致，而与秋茄（Kandelia obovate）（赵森等，2020）、沙枣（Elaeagnus angustifolia）（王婧等，2019）等不同，表明造成密码子使用偏好性的差异因植物而异。
花椒属植物普遍为无融合生殖，无明显杂交优势，物种间或种内个体间遗传变异小（Fei et al., 2021），选用花椒叶绿体基因组为参考，分析竹叶花椒CDS的单核苷酸变异情况，从中共检测到130个SNP，其中matK、rps16、atpA、rpoC1、ndhF、ndhA和ycf1这7个基因的单核苷酸多态性最为丰富，尤其是ycf1基因，共发现了24个单核苷酸变异位点，突变率高达18.5%。然而，研究人员早已在蔷薇科（Wang et al., 2017）、芸香科（Yonguk et al., 2020）植物叶绿体基因组进化和突变模式的研究中指出，在筛选到的几个SNP多态性较丰富的编码基因中以ycf1的单核苷酸变异位点数最多，变异程度也最高，相比其他基因ycf1更有助于种间分类鉴定，这与本研究结果一致。同时，在竹叶花椒叶绿体基因序列中共检测到14个indel位点，并且所有的indel位点均位于基因的内含子区，植物在遗传进化过程中基因内含子区更容易发生碱基的插入或缺失，导致indel位点在此区域产生和积累（Yonguk et al., 2020）。黄平仙等（2020）研究发现，indel标记在基因间隔区和内含子区分布的数量最多，占全部标记的80%以上，并指出从基因间隔区和内含子区开发出来的indel标记多态性更丰富。本研究中检测到的多个indel位点将为花椒属植物分子标记开发及种质资源鉴定提供依据。
高等植物叶绿体基因组核苷酸多态性丰富，从序列中检测到的高变区可被用作开发DNA条形码，这些条形码普遍多态性丰富、辨识性高，可广泛应用于植物分类鉴定及系统发育研究（Herliana et al., 2023；孟文娜等，2024）。以花椒叶绿体基因组序列为参考，在竹叶花椒中发现了3 个高变区（rpoB-trnC-GCA-petN、trnH-GUG-psbA和ycf1），前两个高变区约95%变异位点处于基因间隔区且rpoB-trnC-GCA-petN 的Pi值在0.015水平上也有多态性，显著高于trnH-GUG-psbA和ycf1。这3个叶绿体基因片段作为高变区在现有的研究中已有报道，其中rpoB-trnC-GCA基因间隔区为飘带兜兰（Paphiopedilum parishii）叶绿体基因的高变区（高鑫祯等，2024），trnH-GUG-psbA基因间隔区在红景天属（Rhodiola）植物中因具有高度变异性被作为DNA条形码用于系统发育研究（Zhang et al., 2014），叶绿体基因组中的ycf1基因在扁核木属（Prinsepia）、青冈亚属（Cyclobalanopsis）、榛属（Corylus）植物中均变异丰富（卫永乐等，2018；陈晓丽等，2024），可作为变异热点区进行后续研究。同时，本研究基于rpoB-trnC-GCA-petN高变区序列，构建了花椒主要栽培种的系统发育树。该系统发育树以极高的支持率对花椒属的6种植物进行了划分，3个花椒品种和3个竹叶花椒品种均准确归类至各自的种分支下。同时，发现川陕花椒和花椒在同一个小分支上，表明其亲缘关系较近，可能两者为同一起源地或起源地距离较近（冯世静，2017）。这与刘涵等（2023）基于全长叶绿体基因组构建的芸香科系统发育树中花椒属植物分类结果基本一致，说明筛选到的高变区在花椒属中具有较强的特异性，这也从侧面验证了研究结果的可靠性。
花椒和竹叶花椒叶绿体基因组结构、基因数目和功能类别等具有较高的相似性，基因组中的重复序列和SSR较为丰富；其密码子具有较明显的A/T偏好性且多是受自然选择的影响；基因组序列变异位点丰富且集中分布在少数编码基因上和几个特定的基因间隔区内，如ycf1和rpoB-trnC-GCA-petN；基于此特异性区间构建的系统发育树能对花椒主要栽培种及品种进行较为准确的归类划分和亲缘关系鉴定。