旋花科（Convolvulaceae）隶属于茄目（Solanales），包含56属，约1 900种，广泛分布于世界热带至温带地区，集中于美洲和亚洲，部分属为热带地区所特有（Brummit &；Staples，2007）。旋花科中既有一些物种是重要的食用[如番薯（Ipomoea batatas）]、药用和园林观赏的资源植物，也有一些在维持生物群落多样性中扮演了重要的角色（Brummit &；Staples，2007；Costea &；Stefanović，2009）。

旋花科作为一个重要类群，其分类关系较早引起学者们的关注，Choisy在1834年发表了第一个分类系统，随后依据形态分类学方法建立了至少16个旋花科的分类系统（Austin，1973）。由于不同学者对分类性状的权重不一，因此导致分类系统中旋花科的范畴和等级划分存在诸多差异。目前，广泛使用的范畴分为狭义和广义。狭义的旋花科植物常为一年生或多年生藤本，茎、叶常有乳汁，具双韧维管束，叶互生、螺旋排列，花整齐、两性，花冠合瓣，花冠外常有5条明显的瓣中带，子房不分裂，花柱1或2、顶生（Stefanović et al.，2002；Brummit &；Staples，2007；李攀，2020）。独特的生境和生活习性致使属间部分形态性状发生变异，这给旋花科范围界定和科内等级划定带来一定难度，主要分歧集中在是否纳入茶鹃木属（Humbertia）、菟丝子属（Cuscuta）和马蹄金族（Dichondreae）。虽然分类学者意识到这3个类群与旋花科的密切联系，但因不共享上述狭义旋花科的部分性状，一些学者常将它们各自处理为独立的科（Baillon，1891；Pichon，1947；Austin，1973）。例如，菟丝子属为寄生草本，有吸器，无根，鳞片状叶片，茎缠绕且不为绿色等性状与狭义旋花科差异较大（李攀，2020），Roberty（1952）基于总状花序和稍肉质的蒴果将其处理为菟丝子科，这与Austin（1973）依据染色体数目划分结果一致。马蹄金族则因其子房深2裂或4裂，花柱基生而被独立划分为马蹄金科（Dumortier，1829）。然而，Austin（1998）基于128个性状（包括花部特征、营养器官特征、解剖结构、胚胎结构和染色体数目等）进行分支分析，发现一些性状存在明显的平行演化。因此，若仅依赖形态性状来界定旋花科和划分科下等级的分类系统就会不“自然”。

随着DNA测序技术的快速发展，基于分子证据的系统发育分析可追溯植物的系统发育关系与演化过程，为科的划定提供可靠的证据（王伟和刘阳，2020）。在旋花科内，目前最新的分子系统学研究主要基于细胞器和核基因片段，其结果支持广义旋花科为一个单系，并进一步将其划分成2亚科12族，即茶鹃木亚科[包含1族1属1种，茶鹃木族（Humbertieae）]和旋花亚科[包含11族:心被藤族（Cardiochlamyeae）、丁公藤族（Erycibeae）、马蹄金族、盐帚花族（Cresseae）、猴蜜藤族（Maripeae）、小牵牛族（Jacquemontieae）、菟丝子族（Cuscuteae）、白衫藤族（Aniseieae）、旋花族（Convolvuleae）、鱼黄草族（Merremieae）和番薯族（Ipomoeeae）]（李攀，2020；Stefanovi et al.，2002，2003）。但是，旋花亚科内主要分支之间的关系一直没有解决，如Stefanovi等（2002）先依据4个质体基因数据认为心被藤族为旋花亚科的基部类群，后增加的核基因和线粒体基因数据结果显示，旋花亚科主要分支形成“梳齿”结构（Stefanovi &；Olmstead，2004）。Refulio-Rodriguez和Olmstead（2014）基于10个基因片段的研究结果支持心被藤族和丁公藤族形成单系群，为旋花亚科基部类群。此外，菟丝子属的系统发育位置（Stefanovi &；Olmstead，2004；McNeal et al.，2007）和鱼黄草族分类地位也尚未明晰（Williams et al.，2014；Simões &；Staples，2017）。

基于基因片段序列（如rbcL，matK，trnL-F和ITS等）的一些分子系统学研究解决了不同分类阶元的系统发育关系，极大地促进了对植物类群间的亲缘关系和演化历史的认识（张韵洁和李德铢，2011；曾丽萍等，2014）。然而，因片段序列所含系统发育信息位点有限且每个基因的进化速率不同，其构建的系统发育树之间往往存在拓扑结构差异（Rokas et al.，2003；曾丽萍等，2014）。因此，为了构建更为可靠的系统发育树，需要整合更多的基因或基因组数据。随着测序技术的日益成熟，越来越多的植物基因组得到测序，但因核基因组较大，组装困难，又具有复杂性，使得低拷贝基因筛选困难，这些问题使得在系统发育研究中可用的植物核基因组数据有限。相比较而言，质体基因组因存在多拷贝、变异速率适中、高度保守、多数为单亲遗传和不受遗传重组影响等优点，在植物系统发育基因组学研究中被广泛使用（曾丽萍等，2014；Gitzendanner et al.，2018b；王伟和刘阳，2020）。例如，基于1 827个质体基因组内的78个基因解决了绿色植物主要分支间的系统发育关系（Gitzendanner et al.，2018a），进一步利用2 881个质体基因组内的80个基因重建被子植物质体基因组系统发育树，全面更新了被子植物的系统发育框架（Li et al.，2019）。

本研究收集了广义旋花科主要分支的代表性属、种，基于质体全基因组数据，旨在探讨广义旋花科的范畴并准确构建旋花亚科系统发育框架，以明确菟丝子属系统发育位置和鱼黄草族分类地位的合理性。该研究结果将有助于加深对旋花科演化历程的理解，为菟丝子属寄生习性演变和旋花科花色起源与演化的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

根据Stefanovi等（2003）重新修订的旋花科系统框架，在族水平上对旋花科进行取样，共收集旋花科植物8族21属40种，代表了旋花亚科内的主要分支，仅缺少茶鹃木亚科材料。其中，16属23种的二代测序数据从中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库申请获得，新测序样品的分子材料和凭证标本分别保存在中国西南野生植物种质资源库和中国科学院昆明植物研究所标本馆（KUN）中（表1）。另外，有8属17种的质体基因组数据从GenBank数据库下载（表2），并选取茄科烟草（Nicotiana tabacum，NC001879）作为外类群。

1.2 质体基因组测序和组装

利用植物基因组DNA提取试剂盒 [DP320，天根生化科技（北京）有限公司]，从硅胶干燥的新鲜材料或蜡叶标本材料中提取总DNA，经定量检测后，进行浅层基因组测序（genome skimming）（Zeng et al.，2018）。测序文库大小为350 bp，采用150 bp或250 bp双端，使用Illumina MiSeq或HiSeq 2500软件测序，每个物种获得的测序数据为2 G左右。测序原始序列利用GetOrganelle软件包（Jin et al.，2020）进行de novo组装，并自动成环输出质体全基因组。无法自动组装成环的物种则采取手动拼接策略，将scaffolds文件直接导入Geneious（Kearse et al.，2012），选取该物种亲缘关系最近且自动成环的序列为参考序列，使用LASTZ插件（Harris，2007）进行contigs排序和串联，并进行手动校正和拼接。以发表的Ipomoea nil（AP017304）质体全基因组为参考序列，使用Geneious对其他旋花科物种进行批量相似性注释，相似性参数设为70%。随后对注释结果进行手动校正，其中蛋白编码基因的注释依据参考序列和开放阅读框（open reading frame，ORF）确定起始密码子和终止子位置。

注: * 表示该序列为使用LASTZ手动拼接成环的样品。

Note:* represents manually assembling sequence via using LASTZ.

1.3 序列比对和系统发育分析

用于矩阵构建的数据集共有五类:（1）质体全基因组序列（WCG，去除一个IR区）；（2）大单拷贝区（LSC）；（3）小单拷贝区（SSC）；（4）反向重复区（IR）；（5）蛋白质编码基因（protein coding sequence，CDS）。以烟草为参考序列，利用MAUVE（Darling et al.，2004）检测各条序列共线性，非共线性的序列采用手动调整后再次共线性检测。使用Geneious（Kearse et al.，2012）确定质体基因组四分体结构区域（LSC、SSC、IRa和IRb）边界，分别提取各分区序列和蛋白质编码基因片段，得到用于构建数据矩阵的基础序列。WCG、LSC、SSC、IR区的数据使用MAFFT Online（Katoh &；Standley，2013）基于默认参数进行比对，获得比对矩阵。79个蛋白质基因采用细菌蛋白编码的密码子模式进行比对，每个基因先分别使用Geneious 中的MAFFT插件进行单基因多序列比对，再串联构建联合矩阵。自动比对矩阵在Geneious中进行人工核查和校对，排除异质性非常高的区域，最终得到5个质体基因组数据矩阵，包括LSC和SSC及IR 3个分区矩阵、蛋白质编码基因联合（CDS）矩阵、质体全基因组（WCG）矩阵，矩阵文件与原始序列均已上传到figshare网站（10.6084/m9.figshare.14329949）。采用MEGA X（Sudhir et al.，2018）统计矩阵的长度、变异位点和简约信号位点等信息。

使用RAxML构建最大似然树（maximum likelihood，ML）（Alexandros，2014），5个矩阵都选择GTR+GAMMA+I模型，估算最优的最大似然树（best-scoring ML tree），并设置1 000次bootstrap replicates估算分支的支持率（bootstrap support values，BS）。本研究中，BS≤50为不支持，BS=51~79为弱支持，BS≥80为强支持。

选取WCG和CDS矩阵构建贝叶斯推论树（Bayesian inference，BI）。基于PhyloSuite软件（Zhang et al.，2020）中的ModelFinder 插件（Kalyaanamoorthy et al.，2017）按照BIC准则（Bayesian information criterion，BIC）选择最适碱基替换模型。选择MrBayes 软件（Huelsenbeck &；Ronquist，2001），通过在线CIPRES Science Gateway（Miller et al.，2010）或超级计算机上进行贝叶斯推论分析，设置MCMC运算为2 000 000代，每100代取样1棵系统发育树。先舍弃前25%的抽样树，再构建50%的多数原则一致树（majority rule consensus of trees），并计算每个节点的后验概率（posterior probability，PP）。对所获得的系统发育树均采用Figtree v1.4.0（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）可视化结果。本研究中，PP=0.51~0.94为弱支持，PP≥0.95为强支持。

1.4 系统发育冲突检测

采用AU 检验（approximately unbiased test）（Shimodaira，2002）和SH 检验（Shimodaira-Hasegawa test）（Hidetoshi &；Masami，1999），以判断WCG数据集得到的最优树与其他数据集得到的最优树（包括LSC区的ML树、IR区的ML树和SSC区的ML树）是否有统计学差异。SH检验基于非参数自举法的比较方法，在拒绝零假设方面十分保守，与AU检测一样能够有效控制I型错误，但AU检测比SH检测的偏差小。两种系统发育假设检验借助IQ-TREE 软件（Trifinopoulos et al.，2016），通过最大似然方法，使用RELL算法进行1 000次重复取样，任何一种结果的P值小于0.05，即为显著，表明该拓扑结构与WCG矩阵结果为明显冲突，不支持此拓扑结构。

2 结果与分析

2.1 质体基因组特征

旋花科新测序物种均为典型的四分体结构，由大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）和2个反向重复序列（IR）组成。质体基因组大小为113 273~164 112 bp，LSC区长度为71 518~88 896 bp，SSC区长度为3 087~16 678 bp，IR区长度为22 409~29 081 bp，且GC含量变化范围为37.2%~40.1%（表1）。基因注释结果显示，除菟丝子属外，旋花科自养类群的蛋白质编码基因含量保守，数目为78~79个。菟丝子属因其独特的寄生习性导致部分基因丢失，仅含66个蛋白质编码基因。

2.2 矩阵数据特征

在5个质体基因组比对矩阵中，WCG矩阵长166 691 bp，具有53 093个变异位点（占序列长度的31.9%）和28 675个简约信号位点（占序列长度的17.2%），序列多样性最高；CDS区矩阵长为76 883 bp，具有21 748个变异位点和12 292个简约信号位点，分别占WCG矩阵变异位点和简约信号位点的41.0%和42.9%；IR区矩阵长37 107 bp，具有9 908个变异位点和5 574个简约信号位点；SSC区矩阵长8 232 bp，具有3 596个变异位点和1 966个简约信号位点；LSC矩阵长112 926 bp，具37 053个变异位点和19 699个简约信号位点。

2.3 系统发育分析

在广义旋花科内（包含菟丝子属和马蹄金族），除鱼黄草族（鱼黄草属）外，其他7个族在所有分析中均形成单系（图1，图2）。同时，盐帚花族和马蹄金族互为姊妹群，番薯族和鱼黄草族内的Merremia quinquefolia互为姊妹群，旋花族和部分鱼黄草族物种互为姊妹群，所有分析均强支持这3个分支形成单系群。

基于WCG和CDS联合矩阵，ML和BI分析得到拓扑基本一致的系统树（图1），仅基于CDS矩阵的BI树与ML树存在一个小分支不一致，即大果三翅藤（Tridynamia sinensis）在心被藤族内的系统位置关系。另外，CDS矩阵结果在少数分支上的支持率比WCG矩阵要略低（图1）。在总体上，心被藤族与丁公藤族具有较近亲缘关系在四矩阵分析中都得到了强支持（BS≥86，PP=1.00），二者形成一个分支最早分化出来，是其他广义旋花科姊妹群在WCG矩阵、CDS矩阵和LSC矩阵分析得到了支持（WCG-/CDS-/LSC-BS=100/89/100；WCG-/CDS-PP=0.99/1.00），而IR矩阵显示它们与鱼黄草族等3族（Clade I）可能是姊妹关系（BS=62）（图1）。在WCG矩阵和CDS矩阵中，菟丝子族形成一个孤立的单系分支与其余所有旋花科物种形成姊妹关系（WCG-/CDS-BS=68/74；WCG-/CDS-PP=1.00/1.00），剩下的5个族分为2个分支在所有的分析中都得到了强支持，即旋花族、鱼黄草族和番薯族组成Clade I，盐帚花族和马蹄金族组成Clade Ⅱ。在Clade I中，旋花族和番薯族各自形成单系群，嵌套在鱼黄草族中，且LSC矩阵分析时和菟丝子族聚在一起（BS=60）。但是，IR矩阵（BS=93）和SSC矩阵（BS=61）支持菟丝子族与盐帚花族+马蹄金族为姊妹类群。值得关注的是，鱼黄草属4个种分散在3个不同的分支上，即海南山猪菜（Merremiahainanensis）与旋花族聚在一起（BS≥96，PP=1.00），五叶鱼黄藤（Merremia quinquefolia）与番薯族聚在一起（BS≥98，PP=1.00），剩下2种和其他3种鱼黄草族的属种一起（BS=100，PP=1.00）。番薯属是一个并系类群，所有分析都形成了2个分支（BS=100，PP=1.00），其中1支包括了另4属5种植物。

2.4 系统发生冲突检测

由于WCG矩阵和CDS矩阵与其他3个矩阵构建的系统树存在明显的拓扑结构差异，因此利用AU检验和SH检验进行冲突显著性评估（表3）。检测结果表明，WCG矩阵与LSC矩阵的拓扑结构不存在明显的拓扑结构冲突，即菟丝子族与Clade I构成姊妹关系存在可能（P _AU=0.083 7，P _SH=0.451），但拒绝IR区和SSC区的拓扑结构关系（P值均小于0.001）（表3）。

3 讨论与结论

3.1 广义旋花科的界定

传统分类上，研究者们对性状加权不同，使得旋花科的界定混乱，特别是菟丝子属和马蹄金族（Austin，1973）。多数学者主张将寄生习性的菟丝子属处理为旋花科内单属族（Choisy，1834；Bentham &；Hooker，1873；Peter，1897；Austin，1998）或亚科（Peter，1891），少数学者主张将菟丝子属处理为单属科（Lindley，1853；Roberty，1952，1964；Austin，1973）。另外，还有学者将马蹄金族作为独立的科（Dumortier，1829；Austin，1973；Stefanovi et al.，2003）。本研究的质体基因组系统发育分析结果表明，现在划定的旋花科是一个“自然”类群，即菟丝子属与马蹄金族均应包括在旋花科内，不应独立成科，这与Stefanovi等（2002）基于4个质体基因组片段系统发育结果一致。同时，该结果支持Stefanovi等（2003）对旋花科的科下等级划分，即菟丝子科并入旋花科内为菟丝子族，与马蹄金族一起被置于旋花亚科内。

3.2 旋花亚科的系统发育关系

虽然现有的分子系统学研究已构建了旋花科2亚科12族的系统框架，但旋花亚科内主要分支的系统发育关系尚未厘清，特别是心被藤族、丁公藤族和菟丝子族的系统位置（李攀，2020）。Stefanovi等（2002）基于4个质体基因数据推断丁公藤族和心被藤族各为一个分支，依次位于其他旋花亚科的基部。随后增加线粒体基因atpA、核基因RPB 2和质体基因rpl2后，心被藤族、丁公藤族和旋花亚科其他族形成“梳齿”关系（Stefanovi &；Olmstead，2004），无法确定系统位置。Refulio-Rodriguez和Olmstead（2014）联合9个质体基因和1个线粒体基因序列的分析结果较弱地支持心被藤族和丁公藤族聚为一支，位于旋花亚科基部。由于该研究旋花科取样较少，这2个族各仅有1种，支持率较低，且缺少菟丝子族、盐帚花族等6族的代表，因此二者的亲缘关系和系统位置没有完全澄清。本研究中的4组数据矩阵（除IR矩阵外）分析结果均强支持心被藤族和丁公藤族为姊妹关系，且可能是最早从旋花亚科内分化出来。由于IR区和SSC区矩阵的ML树在这些分支的支持率较弱，因此AU检验和SH检验均显示两种拓扑结构与WCG矩阵的拓扑结构存在明显冲突，这可能是IR区和SSC区基因的核苷酸替换速率不一致所造成的（Zhu et al.，2016）。

针对菟丝子族在旋花科内的系统位置，本研究结果显示，首先WCG矩阵和CDS矩阵强支持Clade I和Clade Ⅱ互为姊妹关系，然后与菟丝子族聚在一起。此结果明显优于之前基于基因片段的研究，如Stefanovi和Olmstead（2004）基于多基因片段分析结果显示，菟丝子族、Clade I和Clade Ⅱ聚在一起形成“梳齿”结构。随后，McNeal等（2007）使用ML和BI法基于质体和核基因片段联合矩阵的结果支持Clade I是菟丝子族的姊妹群，但该结果仅得到rps2基因矩阵支持。值得注意的是，McNeal等（2007）研究表明，rbcL基因矩阵的结果与本研究的LSC矩阵均支持Clade Ⅱ和菟丝族可能为姊妹类群，且拓扑结构冲突检测的结果无法拒绝此拓扑结构。因此，以上这些关系的冲突不仅揭示取样不同的分子数据对菟丝子属系统位置的影响，而且表明若想进一步探讨菟丝子族系统位置，核基因组数据不可或缺。

3.3 鱼黄草族的多系性

鱼黄草族的多系性在以往的研究中多有报道（Stefanovi et al.，2003；Stefanovi &；Olmstead，2004），尤其是其中的鱼黄草属（Simões et al.，2015）。依据单系性的标准，传统概念的鱼黄草族得到一定修订，被移出的属种多归入到白衫藤族，但番薯族仍嵌套在广义鱼黄草族内。此外，由于还有一些鱼黄草属的种分散在鱼黄草族外，因此重新修订过的鱼黄草族仍非单系（Stefanovi et al.，2003）。Stefanovi和Olmstead（2004）采用10个单基因片段联合矩阵结果显示，番薯族先嵌套在广义鱼黄草族中，它们与旋花族共同构成的分支再与白衫藤族构成姊妹群关系。Simões等（2015）进行广泛取样，基于核糖体ITS和叶绿体matK、rps16和trnL-F基因联合矩阵分析表明鱼黄草族确非单系，尤其是鱼黄草属分成了10个分支，且番薯族仍嵌套在广义鱼黄草族中。因此，Simões和Staples（2017）提议废弃鱼黄草族的划分，改用分支的概念，并把一些鱼黄草属的种划入其他属或建立新属，这些处理还需更多证据的支持。我们基于质体基因组系统发育分析结果显示，虽然旋花族和番薯族分别形成单系群位于Clade Ⅱ中，但鱼黄草族分成了3个分支，其中海南山猪菜和五叶鱼黄藤分别与旋花族和番薯族聚在一起。质体系统发育基因组分析结果与Simões等（2015）的研究结果有一些出入，可能是取样偏差、基因数据量差异大、地区特有种等原因造成系统发育推断的分歧。同时，Simões等（2015）的系统树主干分支支持率很低，分支之间的关系存在很多不确定性。因此，对于鱼黄草属的重新修订还需要更深入的研究，特别是特有种的收集和新的基因组数据的使用。

致谢 感谢中国西南野生生物种质资源库大科学工程项目对本研究的支持并提供旋花科的分子材料；感谢中国科学院西双版纳热带植物园公共技术服务中心超算平台的支持。

参考文献