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丽豆（Calophaca sinica）是一种多年生直立灌木，为虫媒异花授粉型植物，隶属于豆科蝶形花亚科丽豆属（Calophaca Fisch. ex DC.）。该属约10个种，有3个种分布在中国，分别是丽豆（C. sinica）、华丽豆（C. chinensis）和新疆丽豆（C. soongorica）（李建平和陈思，2019）。其中，丽豆仅分布在内蒙古阴山山脉以南和山西中南部地区，目前其分布范围仍在不断缩小，其个体数量也在不断变少（马倩，2012），已成为华北地区特有的一种珍稀易危植物（中国科学院中国植物志委员会，1993）。李建平和陈思（2019）研究表明，丽豆种子营养价值较高，富含蛋白质、碳水化合物、糖类等人体不可或缺的营养物质，极具开发潜力。此外，丽豆具有耐寒、耐旱、耐土壤贫瘠的特性，能在较为严峻的环境中生存且能为水土保持做出一定贡献（武红柱等，2017）。然而，我们对这样一种兼具经济和生态双重价值，且处于易危状态的植物却缺乏足够的了解，尤其是利用代谢组学方法对其种子代谢组化学成分的解析鲜有报道。
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植物代谢组学是一门新兴的交叉学科（郭凤丹等，2017），是系统生物学的主要分支之一（曾超珍等，2017）。它可对提取物中参与生物体新陈代谢且相对分子量不足1 000的内源性小分子进行无差别的整体性代谢成分分析（张传义，2018）。代谢组学的研究方法经历了质谱（mass spectrometry，MS）（Verdonk et al.，2003）、高效液相色谱（high-performance liquid chromatog-raphy，HPLC）（林艳萍等，2007）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技术，目前最新的方法是基于液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）的代谢组学技术，此技术可以找到相似物种成分之间的变化趋势，从整体上研究其代谢产物的差异，目前已在植物学（段礼新和漆小泉，2015）、微生物学、医学（Tamas et al.，2011）等各个领域得到了广泛的应用。比如，Rafael等（2019）通过LC-MS代谢组学方法分析了鹰嘴豆（Cicer arietinum）、扁豆（Lens culinaris）和白豆（Phaseolus vulgaris）之间的代谢物差异，结果从43种差异代谢物中鉴定到了3个种间的判别性化合物；Gong等（2020）通过比较代谢组学分析了3个水稻品种食用品质的内在机制，从而揭开了3个品种间口感和风味差异的核心因素；高淑芳等（2022）利用LC-MS技术表征了刀鲚卵巢内400多种化学成分，并通过比较代谢组学方法鉴定出海水刀鲚和淡水刀鲚之间的47种差异代谢物，揭示了二者在卵巢发育上的分化；武绍龙等（2022）采用LC-MS技术鉴定出马缨杜鹃在不同时期的973种代谢物，揭示了马缨杜鹃花从开花至凋谢过程中代谢产物的变化情况；姜武等（2021）对不同种质多花黄精的化学成分进行LC-MS检测，从红杆和绿杆多花黄精样品中共筛选出22种代谢产物，其中在红杆多花黄精中表达量高于绿杆多花黄精的差异代谢物就有15种，此结果可为多花黄精优良品种的选用提供一定的理论支持；Yuan等（2021）探究了西瓜野生种和栽培种间的差异代谢物，共鉴定出431种差异代谢物，为基于代谢组学的西瓜果实改良提供了数据基础，促进了其营养特性的增强或种质的升级。由此可见，基于LC-MS技术的代谢组研究为我们解析不同植物的代谢物差异和营养价值比较提供了一种高效的方法。
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丽豆作为我国华北地区特有的一种珍稀野生植物资源（谢勇等，2018），亟须我们全面了解丽豆的代谢组成分，以评估其营养价值，从而为我们对丽豆资源的深度开发和高效利用提供科学依据。大豆（Glycine max）是丽豆的近缘种，它们同属于豆科蝶形花亚科，也是人们日常植物蛋白最重要的来源之一（武林琳，2022），其所含有的多种生物活性成分对预防各种心脑血管疾病、糖尿病和癌症起到一定的作用（Kumar et al.，2013）。因此，本研究选择大豆为对照样品，采用基于LC-MS技术的比较代谢组方法对丽豆和大豆的代谢产物进行比较，并通过KEGG数据库开展代谢通路富集分析，解析其功能和作用，以期深入评估丽豆的营养价值和应用前景。本研究结果将为我们对丽豆资源的开发利用，以及为将来全面揭示丽豆代谢组组成提供数据基础。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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在本研究中，大豆是生活超市中最常见的黄大豆，而丽豆采自其原生境之一的山西省太原市天龙山自然保护区的山坡灌木丛中（112° 25′ 10.56″ E、37° 43′ 22.44″ N），海拔1 180 m。天龙山自然保护区地处黄土高原及华北平原交界抬升区，海拔落差大，气候分区丰富，属暖温带大陆性季风气候，受季风影响，夏秋多雨并集中，冬春干旱多西北风，多年平均降水量为487 mm（郭艳萍和李洪建，2022），年内降水分配不均，主要集中于7—9月；保护区内植物资源较为丰富，植被覆盖度高，且相对稳定，具有典型的北温带性质（郭秋霞，2021）。按照生态学调查采样方法我们采集了50株丽豆的种子（图1），种子带回实验室后，每株随机选取3~5粒饱满的种子制成1份混合样品用于后续的代谢组分析。
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1.2 代谢物提取
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主要处理流程如下：（1）取大豆和丽豆种子各10 g（大约100粒），研磨仪充分打碎、研磨至粉状待用；（2）在1.5 mL EP管中加入100 μL（约100 mg）步骤（1）中的样本，再加入300 μL甲醇和20 μL内标，涡旋混匀30 s；（3）冰水浴超声10 min；（4）零下20℃ 静置1 h；（5）在4℃，13 000 r·min-1条件下将样本离心15 min；（6）小心取200 μL上清液加入2 mL进样瓶中，再取200 μL QC（quality control）样本上机检测。
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1.3 上机检测
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由沃特世Acquity I-Class PLUS超高效液相串联沃特世Xevo G2-XS QTof高分辨质谱仪组成用于代谢组学分析的液质联用系统，所使用色谱柱为购自沃特世的Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（1.8 μm， 2.1 mm × 100 mm）。
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正离子模式：流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为0.1%甲酸乙腈。负离子模式：流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为0.1%甲酸乙腈。进样体积为1 μL。
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1.4 代谢物定量
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对MassLynx V4.2采集的原始数据使用Progenesis QI软件做峰提取、峰对齐等数据处理操作，基于Progenesis QI软件在线METLIN数据库及北京百迈客生物科技有限公司自建库进行鉴定，同时进行理论碎片识别。分析前先对数据进行归一化处理，采取的方式是总峰面积归一化即每个样本的每个代谢物除以该样本总的峰面积。
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1.5 KEGG分析
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将所有鉴定到的代谢物整理成*.txt文件，上传至KEGG 数据库（https://www.kegg.jp/kegg/）代谢物通路进行注释分析，在注释结果中，选取KO pathway level2条目注释最多的Top20注释信息绘图。
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2 结果与分析
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2.1 丽豆与大豆代谢组成分分析
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丽豆和大豆中共检测到1 857种代谢组成分，分属于68个种类（图2）。其中，其他类的化学成分最多，有1 271种；在剩余的586种代谢组成分中，种类最多的前6位分别为羧酸及其衍生物（即氨基酸类）（135种）、脂肪酰基（68种）、丙烯醇脂质（43种）、有机氧化合物（40种）、类固醇及其衍生物（34种）以及甘油磷脂（28种）。这一结果表明丽豆和大豆一样，含有丰富多样的氨基酸类化合物，具有很好的营养价值。
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2.2 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析
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丽豆与大豆的差异代谢物主要分布在20条代谢途径中，其中P＜0.1的代谢途径有8条，分别是二萜类生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，青霉素和头孢菌素生物合成，肌醇磷酸代谢，糖基磷脂酰肌醇锚定生物合成，生物合成自噬，赖氨酸生物合成，氨基酸的生物合成（图3：a）。
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初级代谢产物富集量最多的通路是氨基酸的生物合成（图3：b），分别为L-缬氨酸↓、L-酵母氨酸↓、苯丙醇胺↓、高柠檬酸↓；赖氨酸生物合成，分别为L-酵母氨酸↓和高柠檬酸↓；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，分别为奎尼酸↑和吡哌酸↓。次级代谢产物富集量最多的通路是各类次生代谢生物合成，分别为罗汉松脂素↑和吡哌酸↓；嘌呤代谢，分别为吲哚-3-甲醛↑和鸟嘌呤核苷↓；甘油磷脂代谢，分别为磷脂酰肌醇↓和溶血磷脂酰胆碱[18∶3（6Z，9Z，12Z）]↓；花生四烯酸代谢，分别为Δ12-前列腺素J2↑和15-脱氧-Δ-12，14-前列腺素J2↓；二萜类生物合成，分别为巴卡丁Ⅲ↑和对映-贝壳杉-16-烯-19-酸↓。综上可见，丽豆和大豆的初生代谢产物差异主要集中在各类氨基酸的生物合成上，且整体表现为下调；次生代谢产物的差异主要集中在罗汉松脂素，花生四烯酸以及二萜类生物合成上，且主要表现为上调。
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2.3 丽豆与大豆差异代谢物分析
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通过对丽豆和大豆的代谢组成分的种类和含量进行两两比较，共检测出159种差异代谢物（表1）。其中，大约30%（48种）的差异代谢物在丽豆中含量高于大豆，且有5种为丽豆中特有成分；剩余约70%（111种）的差异代谢物在丽豆中的含量低于大豆，且有4种在丽豆中未被检出，是大豆的特有成分。由上述结果可见，在代谢物成分的含量上，二者的差异不足10%，即丽豆中超过90%的代谢物在含量上与大豆相似，表明丽豆与大豆一样，具有很高的营养价值；在差异代谢物成分的种类（159种）组成上，丽豆虽然比大豆少4种，但是它比大豆多了5种独有的成分，这表明与大豆相比，丽豆有其独特的营养价值。
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在159种差异代谢物中，丽豆比大豆含量高的化学组分共有43种，其具体的相对含量详见表2。由表2可知，仅有不到10种化学组分属于初级代谢物，如属于氨基酸类代谢过程中的L-苯丙氨酸-L-脯氨酸和丝氨酸-组氨酸，糖类代谢过程中的Gypsogenin 3-O-鼠李糖基葡糖醛酸，28-[葡糖基-（1-＞6）-葡糖基]齐墩果酸3-阿拉伯糖苷，以及β-柠檬酸等。其中，丽豆中L-苯丙氨酸-L-脯氨酸的含量远高于大豆，大约是大豆的40倍；丽豆中β-柠檬酸的含量是大豆的10倍。剩余超过75%的化学组分均为次生代谢物，比如，丽豆在脂肪酰基、苯及其取代衍生物以及其他类化学组分中，有12种化学组分的含量超过大豆10倍之余，它们分别是△12-前列腺素J2、奎尼酸、阿莫曲坦、N-甲基酪胺、氨苄西林、乙磺酰亚胺、4-羟基苯甲酸甲酯、脱落酸、阿魏酸等。此外，与大豆相比，丽豆中还存在5种特有的化学组分，它们分别是3-胍基丙酸、巴卡丁Ⅲ、罗汉松脂素、无效苷和脱乙酰乙烯多林，也都属于次生代谢物。这一结果表明，丽豆比大豆含量高的化学组分主要集中在次生代谢物方面，而在初生代谢物中，仅L-苯丙氨酸-L-脯氨酸具有明显的优势。
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3 讨论与展望
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代谢产物是生物体代谢过程中产生或消耗的有机化合物，它的组成种类和含量决定着植物的营养价值（李静等，2017）。本研究对丽豆和大豆的比较代谢组研究结果表明，在二者中共检测到1 857种代谢产物，而丽豆中超过90%的代谢产物与大豆不仅在成分上相似，含量上也相近，这一结果可能与二者是近缘种有关，同时也表明丽豆与大豆一样，具有很高的营养价值，具备成为我们未来生活中植物蛋白第二来源的潜力。
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在对二者的差异代谢物分析中，我们共检测到159种化学组分，其中有48种（约30%）在丽豆中的含量高于大豆。KEGG注释结果表明，这48种化学组分主要是一些次生代谢物，且大多集中在罗汉松脂素，花生四烯酸以及二萜类生物合成上。比如，△12-前列腺素J2（△12-prostaglandin J2，△12-PGJ2），它在丽豆中的含量是大豆中的107倍，有研究表明利用△12-前列腺素J2形成的以聚乳酸-乙醇酸共聚物为载体的纳米粒（△12-PGJ2-NC）可以使某些骨坏损区的基因和蛋白表达水平上调，可应用于牙周病的治疗，并且在骨坏损的修复方面具有很好的应用潜力和开发价值（Chen et al.，2015）；奎尼酸在丽豆中的含量是大豆中的68倍，它可以抑制血小板的凝集，对脑血栓的形成具有一定抑制效应，在体内还可以转化为特殊物质，对病毒和癌细胞产生抑制作用，可用于抗病毒和抗癌药物的制备，此外奎尼酸还具有抑制疼痛和减轻炎症的效果（周萌，2013）；阿莫曲坦在丽豆中的含量是大豆中的40倍，它是抗偏头痛药物中的有效成分，可用于治疗常见的急性偏头痛发作，且具有很高的血管选择性，耐受性比较好，已被广泛应用（王鹏等，2016）；N-甲基酪胺，在丽豆中的含量是大豆中的31倍，可用于治疗休克（严幼芳等，1983； 戴汉云和熊正东，1989）。氨苄西林（ampicillin），别名氨苄青霉素，在丽豆中的含量是大豆中的13倍，它是一种可以抑制体内致病菌的抗生素，通常用于治疗多种细菌感染疾病如呼吸道、肠道细菌感染、脑膜炎以及感染性心内膜炎等（杨茜等，2022）。乙磺酰亚胺又称乙琥胺，在丽豆中的含量是大豆中的12倍，可用于治疗老年性耳聋（苏毅鹏，2014）和儿童失神性癫痫（范磊和陈海燕，2013）。4-羟基苯甲酸甲酯和脱落酸，在丽豆中的含量是大豆中的11倍，前者能延缓与年龄相关的生理过程的衰退（Mi et al.，2018），后者可以抑制多种癌细胞的增殖，还可以促进间质干细胞的增大和定向造血干细胞的生长，是多种疾病治疗的潜在药物（郭天艺，2017）。阿魏酸在丽豆中的含量超过大豆10倍，有研究表明，阿魏酸可以抑制炎症反应，达到治疗动脉粥样硬化的目的（杨琳洁等，2021）。
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图1 丽豆植株（a）及种子（b）照片
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Fig.1 Photos of plant (a) and seeds (b) of Calophaca sinica
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图2 丽豆与大豆代谢组成分类别统计
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Fig.2 Categorical statistics of metabolic components of Calophaca sinica and Glycine max
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图3 差异代谢物通路分类图（a）和KEGG富集图（b）
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Fig.3 Differential metabolites pathway classification map (a) and KEGG enrichment map (b)
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除了上述化学组分外，本研究还发现了一些丽豆特有的化学组分。比如，β-胍基丙酸，它对于调节血糖水平、改善高血糖症具有一定的疗效，且β-胍基丙酸是一种可以溶于水的结晶粉末，因此糖尿病患者有时会将其加入食物中作为补充剂（Baumgarner et al.，2015）。巴卡丁Ⅲ是丽豆中的又一特有组分，它是紫杉酚的前体，它可以显著促进机体产生更强的免疫球蛋白，还可诱导机体产生Th1和Th2型免疫反应，是一种理想的待开发疫苗佐剂（袁林等，2014）。此外，还有罗汉松脂素，又称马泰瑞松醇，它是一种较为常见的植物木酚素，具有抗肿瘤血管发生、减弱真菌活性、消除体内自由基和抗癌作用（Xu et al.，2017）。
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综上所述，我们认为丽豆的营养价值与大豆相似，且其富含的一些次级代谢产物在改善人体多种疾病方面有积极的作用。此外，本研究结果也表明丽豆种子的代谢产物种类丰富，尤其有些对人体非常重要的次生代谢物，具有很高的开发价值，这些都为我们后期深入研究丽豆的营养价值以及科学地规划人工栽培提供了参考和借鉴。
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注： ↑表示该差异代谢物在丽豆中的含量高于大豆；↓表示该差异代谢物在丽豆中的含量低于大豆。
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Note: ↑ means that the content of differential metabolite in Calophaca sinica is higher than that in Glycine max; ↓ means that the content of differential metabolite in Calophaca sinica is lower than that in Glycine max.
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续表2
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摘要
丽豆 (Calophaca sinica) 是我国华北地区特有的一种珍稀野生植物。为探明丽豆的营养价值，该文以大豆（Glycine max）为参照组，利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术对其种子进行了比较代谢组学研究。结果表明：(1) 丽豆和大豆中共检测到1857种代谢产物，二者成分相同且含量相似的代谢物有1698种（＞90%），差异代谢物有159种（＜10%）。(2) 在差异代谢物中，成分差异的有9种，其中有5种为丽豆特有，剩余150种均为含量差异，其中48种（约30%）在丽豆中的含量高于大豆。(3) KEGG注释到8条差异代谢物显著富集 (P＜0.1) 的通路，主要包括初生代谢物的各类氨基酸生物合成途径和次生代谢物的罗汉松脂素、花生四烯酸以及二萜类等生物合成途径。(4) 丽豆比大豆含量低的化学组分主要是初生代谢产物，比大豆含量高的化学组分主要是次生代谢物，而这些次生代谢物在调节血糖、骨坏损修复、增强免疫以及消炎抗癌等生理过程中有着积极的作用。综上所述，该研究认为丽豆与大豆具有相近的营养价值，并且对改善人类亚健康状况有积极的影响；此外，该文使我们对丽豆的营养价值和代谢组成分都有了较为全面的了解，同时也为我们对丽豆资源的深度开发和高效利用提供了必要的数据基础。
Abstract
Calophaca sinica is a rare wild plant endemic to North China. To explore the nutritive value of C. sinica, the comparative metabolomics of C. sinica and Glycine max (as control group) seeds were studied by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The results were as follows: (1) A total of 1857 metabolites were detected in these two species, and 1698 metabolites were similar in composition and content (＞90%), and only 159 differential metabolites (＜10%). (2) Among the metabolites, nine were different in components, of which five were unique to C. sinica, and the others 150 were different in content, of which 48 chemical components (about 30%) were higher in C. sinica than in Glycine max. (3) Eight pathways were significantly enriched with differential metabolites (P＜0.1) by KEGG annotation, and it mainly including the biosynthesis pathways of primary metabolite (various amino acid) and secondary metabolites (such as matairesinol, arachidonic acid and diterpenoids). (4) Among these statistically significant differential chemical components, of which lower content in Calophoca sinica are mainly primary metabolites, and higher content are mainly secondary metabolites. These secondary metabolites play an active role in regulating blood glucose, repairing bone damage, enhancing immunity, anti-inflammatory and anti-cancer. In summary, the result supports that the nutritional value of C. sinica is similar to that of Glycine max, and it also has a positive effect on improving human sub-health status. Meanwhile, this study provides us a relatively comprehensive understanding of the nutritive value and metabolic components of Calophaca sinica and necessary data for the deep development and efficient utilization of C. sinica resources in future.
Keywords
Calophaca sinica ； Glycine max ； LC-MS ； metabolome ； component analysis
